銀杏果仁中一種抗菌蛋白的分離純化及基因克隆.pdf

1、植物在生長發(fā)育的過程中，不可避免的遇到各種病源微生物的攻擊，它們已經(jīng)進化出許多防御機制來抵抗這種病源微生物的侵害，其中包括許多組成性或誘導性抗菌多肽或蛋白的合成。這些抗菌蛋白不但具有強的抗菌活性，而且抗菌譜廣，在植物病害防治中越來越受重視。首先這些抗菌蛋白純化之后可以直接用做“生化試劑”，其次可以通過測定抗菌蛋白的序列從而在原植物中克隆出其基因，這是在植物抗病基因工程中抗病基因的一個重要來源。由于這些抗菌蛋白都源于植物內(nèi)源表達的基因，所

2、以從轉(zhuǎn)基因植物安全性的角度上考慮更易于被人們接受。 本實驗以銀杏種仁為研究材料，對比了常壓柱層析、離心式離子交換層析加電洗脫及AKTA Purifier層析三種蛋白分離純化方法。最終使用AKTA Purifier層析系統(tǒng)，通過40％及80％(NH<,4>)<,2>SO<,4>分級鹽析，CM Sepharose F．F．陽離子交換層析和Superdex 75凝膠過濾層析對銀杏果仁粗提液進行了分離純化；得到了一種抗菌蛋白，其分子量大

3、約為13300Da左右。實驗表明，純化后的蛋白對真菌黃瓜鐮刀孢菌(Fusarium oxysporum)具有明顯的抑制作用。通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)分析，得到了該抗菌蛋白相應的肽質(zhì)量指紋譜(PMF)，通過Mascot比對NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫，鑒定該蛋白為銀杏果仁中的一種抗菌蛋白。根據(jù)質(zhì)譜比對分析得到的同源序列為模板設計引物，擴增基因，并且將其克隆測序。期望通過抗菌蛋白基因的克隆、表達進