家蠶中一個(gè)新Kazal型蛋白酶抑制劑的表達(dá)、定位及其功能研究.pdf

1、Kazal型蛋白酶抑制劑廣泛存在于生物體內(nèi)，對(duì)機(jī)體的發(fā)育和免疫應(yīng)答等生理過程發(fā)揮極其重要的作用。該類抑制劑一般由一個(gè)或多個(gè)Kazal型結(jié)構(gòu)域組成，并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有保守的序列結(jié)構(gòu)特征和三維構(gòu)像，通常認(rèn)為每個(gè)結(jié)構(gòu)域均能形成三對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵且其抑制專一性取決于P1活性位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室從中期蠶蛹中成功克隆到一個(gè)全長(zhǎng)為1036 bp的基因序列(BmSPI)，該序列為首次報(bào)道，在GenBank的登錄號(hào)為：DN236893，其ORF框?yàn)?33 bp，編

2、碼310個(gè)氨基酸。將該推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行同源性(BlastP)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有三個(gè)保守的Kazal型結(jié)構(gòu)域(C-X<,3>-C-X<,9>-C-X<,6>-Y-X<,7>-C-X<,3>-C-X<,11>-C)和三個(gè)不同的P1活性位點(diǎn)：蘇氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酰氨(Q)，通過SignalP3.0分析發(fā)現(xiàn)該蛋白N末端不存在信號(hào)肽。通過PCR擴(kuò)增目的基因完整的ORF框，經(jīng)過BamHI和XhoI雙酶切，將該基因重組到GST融合表

3、達(dá)載體pGEX-5X-1后轉(zhuǎn)化TG1中質(zhì)粒擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)star中進(jìn)行表達(dá)分析。通過GST親和層析，得到較純的融合目的蛋白GST-BmSPI，F(xiàn)actor Xa因子將融合蛋白中的GST切除后，再通過反相快速液相色譜(RP-FPLC)進(jìn)一步純化，質(zhì)譜鑒定該蛋白的分子量為33.642 kDa。對(duì)Thrombin、Subtilisin A、Chrymotrypsin體外酶抑制試驗(yàn)表明BmSPI對(duì)Subtilisin有強(qiáng)烈的抑

4、制作用，進(jìn)一步研究表明該蛋白與Subtilisin能形成摩爾比例為1：1的復(fù)合體且其抑制常數(shù)為3.35 nM。將經(jīng)過RP-FPLC純化的BmSPI作為抗原免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該抗血清的效價(jià)達(dá)到1：106000以上。將爬片的Bm5細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BmSPI表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞核中幾乎沒有。取五齡家蠶做橫切冷凍切片，用Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗做免疫組織定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白幾乎遍及各組織中，特別是表皮中含量最高。提