融合多角體的家蠶膜蛋白BmCPH43的表達純化及結晶研究.pdf

1、為了探討膜蛋白的表達問題，本研究從本試驗室家蠶膜蛋白庫中選取了BmCPH43蛋白，預測該蛋白有兩個跨膜區(qū)，N端有一個信號肽。由保藏菌株質粒擴增得到BmCPH43基因的ORF序列，該cDNA序列全長568bp，含有一個243bp的完整開放閱讀框(ORF:204---428bp)，編碼80個氨基酸殘基，預測分子量為8.2kD，等電點為5.27。將BmCPH43基因片段前連接多角體片段并克隆到大腸桿菌表達載體pET-32a(+)相應的酶切位點

2、中，構建了融合有多角體基因的重組pET-32a(+)載體，在多角體與BmCPH43之間引入了TEV蛋白酶切位點序列。經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組質粒正確。將該重組質粒轉化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG低溫誘導(28℃)表達后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，與陰性對照相比在55kD(融合標簽18kD)附近有一條特異性蛋白條帶，與預測值相符。
　　 重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，分別采用兩種不同的

3、方法進行純化。一種通過多角體蛋白在堿性條件下溶解的特性，通過調節(jié)pH值的方法反復洗滌，對重組蛋白進行純化，經(jīng)溶菌酶消化、離心和不同pH值的緩沖液洗滌即可得到純度在70％以上的重組蛋白的粗提物；另一種是利用親和層析的方法純化重組蛋白，通過尿素溶解包涵體，溶解上清通過NI親和柱純化重組蛋白。將純化后的重組蛋白進行AcTEV酶切消化，SDS-PAGE結果顯示，相比陰性對照，酶切樣品多出兩個條帶，其大小分別對應BmCPH43和融合有pET-32

4、a(+)載體標簽的多角體蛋白的大小。
　　 通過調節(jié)pH值純化重組蛋白，以懸滴法點結晶，置于16℃結晶室培養(yǎng)。通過對結晶條件的摸索，確定在蛋白含量lmg/ml容易形成結晶，獲得了融合有多角體的膜蛋白的結晶。
　　 真核表達通過家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)Bac-to-Bac系統(tǒng)進行表達，通過SDS-PAGE及Western Blotting分析證明，融合蛋白Ph-BmCPH43已成功表達。RNAi、MTT檢測結果表明BmCPH4