過表達miR-506通過靶向星形細胞上調基因(AEG-1)抑制骨肉瘤的增殖并促進其凋亡.pdf

1、背景和目的：
　　骨肉瘤是兒童和青少年中一種非常普遍的原發(fā)惡性骨瘤，其特點為具有破壞周圍組織并幾乎專一地向肺轉移的高度惡化的傾向，這些是其引起死亡的主要原因。在年輕的病人中，它主要定位于股骨遠端和股骨近端區(qū)域。盡管骨肉瘤已經面對新輔助化學療法和手術的聯合治療超過30年，再發(fā)或者轉移的骨肉瘤患者仍然存在極差的預后，伴隨著不到10％的長期生存。到目前為止，骨肉瘤的發(fā)生，發(fā)展和轉移的潛在的分子機制仍不完全為人們所知。因此，鑒定針對骨肉瘤

2、的新的治療靶位和發(fā)展治療策略仍是非常必要的。
　　miRNAs作為一組小非編碼單鏈的RNA片段，其長度大小為18-25個核苷酸，這類非編碼RNA在腫瘤形成和癌癥進展中發(fā)揮關鍵的調控作用。近期的研究表明，這些miRNAs可以通過與其靶基因的mRNA的3’-UTR或者編碼區(qū)不完全的堿基互補配對來抑制其翻譯成蛋白質或者直接降解其mRNA片段。這些數據表明，miRNAs可以用來作為診斷生物標志物并發(fā)揮其致癌基因或者抑癌基因的功能作用，其致

3、癌性或抑癌性是基于其靶向的mRNAs的功能決定的。據報道，許多miRNAs，例如miR-29，miR-125b，miR-143，miR-199a-3p等等，可以參與骨肉瘤（OS）的腫瘤生長、進展和轉移等過程。先前的研究表明，惡性轉移的支氣管上皮細胞中miR-506的恢復可以抑制細胞的增殖作用。miR-506的過表達可以抑制上皮-間葉細胞的轉變并抑制人乳腺癌細胞的粘附，入侵和遷移。而且，miR-506在建立的羥基喜樹堿耐受的結腸癌細胞中的

4、過表達可以通過抑制過氧化物酶體活化的受體α(PPARα)的表達發(fā)揮對羥基喜樹堿的耐受作用。雖然近年來miR-506已經得到了廣泛的研究，然而它在骨肉瘤（OS）發(fā)起和進展中的作用以及其發(fā)揮功能作用的分子機制仍知之甚少。
　　本課題包括以下三部分：第一部分：AEG-1和miR-506在骨肉瘤（OS）中的功能研究；第二部分：miR-506通過靶向抑制AEG-1發(fā)揮對骨肉瘤（OS）的功能作用；第三部分：miR-506、AEG-1通過調節(jié)W

5、nt/β-catenin信號通路發(fā)揮其對骨肉瘤（OS）的抑制作用。
　　第一部分 AEG-1和miR-506在骨肉瘤（OS）中的功能研究
　　方法：
　　1.通過western blot和real-time PCR的方法分別檢測了AEG-1和miR-506在骨肉瘤（OS）組織和細胞系MG63中的表達水平。
　　2.通過MTT實驗檢測AEG-1的敲低或miR-506過表達對骨肉瘤（OS）細胞系MG63細胞活性的影響

6、。
　　3.通過流式細胞術的方法檢測 AEG-1的敲低或 miR-506過表達對骨肉瘤（OS）細胞系MG63的細胞凋亡的影響。
　　4.通過構建骨肉瘤（OS）的小鼠模型，在體內實驗中驗證miR-506對骨肉瘤（OS）的功能作用。
　　結果：
　　1.骨肉瘤（OS）中miR-506的表達水平與AEG-1的蛋白表達水平呈現負相關。
　　2. AEG-1的敲低或miR-506的表達上調可以抑制骨肉瘤（OS）細胞系

7、MG63的增殖。
　　3. AEG-1的敲低或miR-506的表達上調可以促進骨肉瘤（OS）細胞系MG63的凋亡活性。
　　4. miR-506的過表達可以抑制體內實驗中骨肉瘤（OS）的細胞生長。
　　第二部分 miR-506通過靶向抑制AEG-1發(fā)揮對骨肉瘤（OS）的功能作用
　　方法：
　　1.通過生物信息學分析推測miR-506的靶基因。
　　2.構建野生和突變型的AEG-13’-UTR的重組質

8、粒，通過雙熒光素酶報告實驗驗證 miR-506的靶基因。
　　3.通過western blot和real-time PCR的方法檢測miR-506過表達和敲低后AEG-1的表達。
　　結果：
　　1.生物信息學預測顯示AEG-1為miR-506的靶位基因。
　　2.雙熒光報告基因實驗驗證AEG-1為miR-506的靶位基因。
　　3. miR-506的過表達可以抑制骨肉瘤（OS）細胞系MG63中AEG-1的

9、表達。
　　第三部分 miR-506、AEG-1通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮其對骨肉瘤（OS）的抑制作用
　　方法：
　　1.通過western blot和real-time PCR的方法檢測miR-506過表達或AEG-1的敲低對β-catenin，c-myc和cyclin D1的表達水平的影響。
　　2.通過流式細胞術的方法檢測si-β-catenin造成的Wnt/β-catenin信號通路

10、的抑制對骨肉瘤（OS）細胞系MG63細胞凋亡的影響。
　　3.通過流式細胞術的方法檢測 Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制CGP049090對骨肉瘤（OS）細胞系MG63功能的影響。
　　結果：
　　1. miR-506的表達上調和AEG-1的表達下調可以明顯降低骨肉瘤（OS）細胞系MG63中β-catenin，c-myc和cyclin D1的表達水平。
　　2. si-β-catenin造成的Wnt

11、/β-catenin信號通路的阻斷可以抑制骨肉瘤（OS）細胞系MG63的細胞增殖并誘導其細胞凋亡。
　　3. Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制CGP049090可以抑制骨肉瘤（OS）細胞系MG63的細胞增殖并誘導其細胞凋亡。
　　結論：
　　1.骨肉瘤（OS）中miR-506的表達水平與AEG-1的蛋白表達水平呈現負相關。
　　2. miR-506的表達上調可以抑制骨肉瘤（OS）細胞系的增殖。