MiR-124通過靶向Sp1基因抑制膠質瘤細胞遷移及侵襲的實驗研究.pdf

1、背景及目的：膠質瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，具有很強的侵襲性及高復發(fā)率、高死亡率等特點，盡管近年來多種臨床治療方法的改進，膠質瘤病人預后和生存情況仍舊很差，對此有效的新型治療方案的研究對臨床改進非常有必要，例如膠質瘤發(fā)病的分子機制的研究。微小RNA（miRNAs），一類保守的非編碼RNA，負向調(diào)控人類至少30％的基因通過轉錄后水平完全或者部分結合靶向mRNA的3’-UTR區(qū)域，進而降低翻譯效能和影響mRNA的穩(wěn)定性。最近研

2、究表明，miRNA作為促癌基因或者抑癌基因，參與腫瘤細胞多種生物學過程，比如細胞增殖、分化、轉移、凋亡等。miRNA-124已經(jīng)被證明能夠抑制多種與轉移相關的腫瘤，包括膠質瘤，而且文獻已經(jīng)證實miR-124的表達量在膠質瘤中是明顯降低的。Sp1作為一個研究較透徹的轉錄激活因子，通過結合靶基因中富含GC的序列，該序列對下游基因的調(diào)控較為廣泛，比如，和EMT相關的一個間質細胞標志物vimentin的表達，間接發(fā)揮調(diào)控腫瘤細胞的生物學作用。先

3、前研究已經(jīng)指出，Sp1可以聯(lián)合其他復合物共同激活vimentin的啟動子以促進其表達，而且越來越多的研究表明Sp1通過調(diào)控涉及腫瘤轉移的基因進而影響多種類型腫瘤的轉移。對膠質瘤而言，先前的研究已經(jīng)表明Sp1在膠質瘤中高表達，并且可以作為一項判斷膠質瘤病人預后的指標?？紤]到miR-124和Sp1均與轉移性腫瘤相關加上膠質瘤浸潤特性，結合生物預測軟件，我們猜測miRNA-124可能通過靶向Sp1來調(diào)控膠質瘤的遷移和侵襲。
　　方法：<

4、br>　　1、首先選取U87、U251、A172、OLN93四株細胞利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）及western blot方法檢測四株細胞中的mirR-124和Sp1本底表達量；
　　2、選用人腦膠質瘤細胞株U87、A172作為研究對象，
　?。?）兩珠細胞過表達miR-124，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）來檢測miR-124表達量以及相對應的Sp1 mRNA表達量，western blot實驗檢測過

5、表達miR-124后Sp1和vimentin表達量，熒光素酶報告實驗進一步證明miR-124靶向結合Sp1，transwell實驗用來證明miR-124的生物學作用；
　?。?）基因敲除方法靶向敲除Sp1基因，分別利用western blot檢測 Sp1和vimentin的表達，transwell實驗進一步來確定Sp1的生物學作用。
　　結果：qRT-PCR結果顯示：和正常膠質細胞OLN93相比，miR-124的表達量在膠質

6、瘤細胞U87，U251，A172細胞中明顯下調(diào)；膠質瘤細胞中Sp1在mRNA和蛋白質層面上的表達量均高于正常膠質細胞；U87和A172過表達miR-124后，Sp1和vimentin的表達均下降，同時抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力，雙熒光素酶實驗也驗證了miR-124靶向結合Sp1的3‘-UTR區(qū)。敲除Sp1基因后，western blot實驗結果提示Sp1和vimentin的表達量下降，同時膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力也是下降的。