TSSC3-RanBP9調(diào)控骨肉瘤失巢凋亡及EZH2促進(jìn)骨肉瘤增殖并影響TSSC3表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、骨肉瘤是最常見(jiàn)的骨組織惡性腫瘤，它是導(dǎo)致兒童和青少年癌癥相關(guān)死亡的第二位原因。近年來(lái)由于新輔助化療的臨床應(yīng)用，有效地改善了患者的5年有效生存率。但是，骨肉瘤的致死率和致殘率仍然很高，近20年骨肉瘤的治療進(jìn)展十分緩慢。因此，目前亟需開(kāi)發(fā)更具靶向性的新的治療骨肉瘤的方法。
　　腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟事件，失巢凋亡抵抗是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的先決條件，與化療藥物抵抗性和不良預(yù)后相關(guān)。因此探討骨肉瘤細(xì)胞的失巢凋亡抵抗、化療藥物抵抗和遠(yuǎn)處

2、轉(zhuǎn)移的機(jī)制將為深入闡明骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移及耐藥提供進(jìn)一步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　印跡基因TSSC3(tumor-suppressing STF cDNA3)是我課題組利用基因芯片技術(shù)在成骨細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中篩選出的差異表達(dá)明顯的基因，它在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。TSSC3可以在體內(nèi)和體外抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，但是TSSC3參與調(diào)控骨肉瘤失巢凋亡以及肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制并不明確。而作為印跡基因，TSSC3的表達(dá)主要受表觀遺傳學(xué)機(jī)制的調(diào)

3、控，EZH2(enhancer ofzeste homolog2)是介導(dǎo)組蛋白甲基化修飾的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子，它是否參與調(diào)控并抑制TSSC3在骨肉瘤中的表達(dá)，目前并無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　因此，本課題共分為以下兩個(gè)部分:
　　第一部分?jǐn)M采用酵母雙雜交系統(tǒng)釣取與TSSC3發(fā)生相互作用的蛋白，并采用免疫共沉淀、酵母雙雜交方法驗(yàn)證兩蛋白的相互作用，明確介導(dǎo)二者相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;并進(jìn)一步利用共轉(zhuǎn)染差異表達(dá)TSSC3和其相互作用蛋白

4、RanBP9，明確TSSC3與其相互作用蛋白(RanBP9)在骨肉瘤失巢凋亡和轉(zhuǎn)移中的作用和相關(guān)分子機(jī)制。
　　第二部分?jǐn)M采用免疫組化和qRT-PCR檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞和組織中EZH2和TSSC3表達(dá)，并對(duì)EZH2對(duì)骨肉瘤生物學(xué)效應(yīng)的影響以及TSSC3在其中的作用進(jìn)行初步研究，目的在于闡明骨肉瘤中EZH2和TSSC3的表達(dá)及生物學(xué)意義，以及EZH2對(duì)TSSC3的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，以期為骨肉瘤的表觀遺傳學(xué)治療提供初步的理論基礎(chǔ)。
　

5、　主要研究結(jié)果如下:
　　第一部分:
　　1.RanBP9是TSSC3在骨肉瘤細(xì)胞中新的相互作用蛋白，二者的相互作用由RanBP9的SPRY結(jié)構(gòu)域和TSSC3的PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，且二者在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平均存在相互調(diào)節(jié)的作用。
　　2.TSSC3/RanBP9的表達(dá)與骨肉瘤細(xì)胞的高遷移、侵襲和失巢凋亡抵抗等表型呈負(fù)相關(guān)。
　　3.TSSC3/RanBP9表達(dá)與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移亦呈負(fù)相關(guān)。
　　4.RanBP

6、9與TSSC3在體外實(shí)驗(yàn)中協(xié)同抑制了骨肉瘤細(xì)胞的錨著依賴生長(zhǎng)、侵襲遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯著抑制了骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。
　　5.RanBP9的SPRY結(jié)構(gòu)域在TSSC3/RanBP9復(fù)合物介導(dǎo)的失巢凋亡抵抗效應(yīng)中起重要作用
　　6.RanBP9發(fā)揮其支架蛋白的作用與Src、TSSC3形成一個(gè)三聚體，而后抑制Src以及Src介導(dǎo)的Akt通路的激活，并促進(jìn)內(nèi)源性線粒體途徑介導(dǎo)的失巢凋亡。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了一

7、個(gè)新的可以和TSSC3發(fā)生相互作用的蛋白R(shí)anBP9，且TSSC3和RanBP9協(xié)同抑制骨肉瘤的失巢凋亡抵抗和侵襲轉(zhuǎn)移，該過(guò)程是由依賴Src的PI3K/Akt通路介導(dǎo)的。因此，RanBP9和TSSC3可能均在骨肉瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。該部分結(jié)果可以為以RanBP9和TSSC3雙靶點(diǎn)的骨肉瘤治療提供初步的理論基礎(chǔ)。
　　第二部分:
　　1.EZH2在人骨肉瘤組織和細(xì)胞中呈異常高表達(dá)。
　　2.EZH2與骨肉瘤臨床病理學(xué)

8、參數(shù)的相關(guān)性:EZH2與骨肉瘤臨床分期、分級(jí)和遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，同時(shí)EZH2的表達(dá)與TSSC3呈負(fù)相關(guān)。
　　3.敲低EZH2的表達(dá)可以在體內(nèi)和體外抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。
　　4.抑制EZH2可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，抑制其侵襲遷移能力。
　　5.敲低EZH2可以抑制骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。
　　6.抑制EZH2的表達(dá)，可以通過(guò)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
　　7.沉默EZH2可以

9、上調(diào)TSSC3的表達(dá)，EZH2可能通過(guò)組蛋白27位賴氨酸的三甲基化(H3 K27me3)介導(dǎo)TSSC3的表達(dá)沉默。
　　8.EZH2通過(guò)抑制TSSC3的表達(dá)發(fā)揮其促癌作用。
　　綜上所述，EZH2在骨肉瘤中異常高表達(dá)，且敲低EZH2后可以在體內(nèi)和體外顯著抑制骨肉瘤的增殖和侵襲能力，而敲低EZH2的上述生物學(xué)效應(yīng)與其對(duì)印跡基因TSSC3的表觀沉默作用相關(guān)。因此，EZH2可能在骨肉瘤中起癌基因的作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。該部分實(shí)