骨保護素通過Fas-FasL死亡受體通路誘導(dǎo)破骨細胞及其前體細胞發(fā)生凋亡的研究.pdf

1、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)發(fā)現(xiàn)于上世紀九十年代，它作為腫瘤壞死因子受體（TNF）超家族成員之一，能通過阻斷核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和RANK結(jié)合來完成誘騙受體功能，從而抑制破骨細胞(OCs)的分化和活性。本課題組最新研究發(fā)現(xiàn)OPG可誘導(dǎo)體外成熟破骨細胞發(fā)生凋亡，這種凋亡可能是OPG抑制成熟破骨細胞活性的主要途徑，然而OPG在OCs存活以及凋亡中的確切作用仍不清楚。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)?；l(fā)展，

2、動物骨營養(yǎng)不良性疾病的發(fā)生越來越多，目前仍缺乏高效的防控藥物。本文以原代分離小鼠骨髓誘導(dǎo)分化為OCs及破骨細胞前體細胞(OPCs)為研究對象，OCs分化成熟后添加不同濃度OPG，通過TACS-XL Blue法（TUNEL凋亡檢測衍生法）、實時熒光定量PCR(QRT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)等技術(shù)手段，揭示OPG對OCs和OPCs凋亡中形態(tài)、功

3、能、相關(guān)基因及關(guān)鍵信號蛋白的影響，以期闡明OPG誘導(dǎo)OCs和OPCs凋亡的分子機制，為相關(guān)藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)和新思路。研究內(nèi)容如下:
　　1.OPG誘導(dǎo)破骨細胞及其前體細胞凋亡
　　為了研究OPG對體外培養(yǎng)小鼠OCs和OPCs凋亡的影響，取8-12周齡Balb/cJ小鼠的骨髓細胞，體外培養(yǎng)過程中采用巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)+ RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)分化為OCs和OPCs，作為OCs和OPCs細胞模型;同時運用僅添加

4、M-CSF的培養(yǎng)基誘導(dǎo)為單一OPCs細胞模型，在體外培養(yǎng)5d，隨后雙細胞因子處理組去除RANKL，在兩種模型中均分別加入不同濃度OPG(0、20、40、80 ng/mL)進行處理。通過Annexin V-FITC熒光染色法，AnnexinV-PI流式法及TACS-XL Blue法，檢測OPCs的早期凋亡、晚期凋亡以及OCs的凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，OPG處理組OPCs的凋亡率顯著增加(P＜0.05)，其中早期凋亡率及晚期凋亡率

5、在40 ng/mL OPG處理組達到最高值。與對照組相比，OPG處理組OCs的凋亡率顯著增加，呈劑量一效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。
　　2.OPG對破骨細胞凋亡相關(guān)基因的影響
　　為了研究OPG誘導(dǎo)OCs凋亡中凋亡相關(guān)基因的變化，采用M-CSF+RANKL誘導(dǎo)原代小鼠骨髓細胞分化形成OCs，在體外培養(yǎng)5d，去除RANKL，各組分別添加不同濃度的OPG(0、20、40、80ng/mL)。培養(yǎng)結(jié)束后收集OCs，提取總RNA和總蛋白

6、，QRT-PCR和Western blot法檢測凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPG處理使得OCs中促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P＜0.05)，抑凋亡基因Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P＜0.01)，呈劑量一效應(yīng)關(guān)系。同時，Western blot結(jié)果表明，與對照組相比，隨著OPG濃度的增加，Bax的表達量上升、Bcl-2的表達量下降，Bax/Bcl-2極顯著增加(P＜0.01)。表明OPG能通過促進促凋

7、亡基因表達和抑制抑凋亡基因表達來誘導(dǎo)破骨細胞凋亡。
　　3.OPG誘導(dǎo)OCs和OPCs凋亡的Fas/FasL死亡受體途徑
　　為了研究OPG誘導(dǎo)OCs和OPCs凋亡對Fas/FasL死亡受體途徑的影響，在上述雙因子處理誘導(dǎo)而來的OCs和OPCs中加入相應(yīng)濃度的OPG和/或Fas/FasL死亡受體通路拮抗劑進行處理。通過QRT-PCR技術(shù)及Western blot等技術(shù)，研究OPG對OCs和OPCs的Fas/FasL死亡受體途

8、徑相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達水平的影響。此外，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)及Co-IP法檢測可溶性FasL(sFasL)在細胞上清中濃度的變化，以及其與OPG的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，20和40 ng/mL OPG能顯著增加Fas的轉(zhuǎn)錄及表達水平和caspase-8的活化程度，但80 ng/mL OPG處理會顯著地降低Fas的轉(zhuǎn)錄及表達水平（P＜0.05）。同時，與對照組相比，OPG處理顯著增加FasL的轉(zhuǎn)錄及表達水平，但上清中的

9、sFasL含量顯著減少（P＜0.05）。運用Fas/FasL死亡受體途徑的拮抗劑與OPG共處理能極顯著減弱OPG處理引起的caspase-8和caspase-3活化增強(P＜0.01)。Co-IP法檢測發(fā)現(xiàn)OPG能與sFasL結(jié)合。這一結(jié)合會阻滯sFasL對OCs和OPCs凋亡的抑制作用。
　　4.OPG誘導(dǎo)破骨細胞凋亡的線粒體途徑
　　為了研究OPG誘導(dǎo)OCs和OPCs凋亡的線粒體途徑，在上述雙因子處理誘導(dǎo)而來的OCs和O

10、PCs中分別添加相應(yīng)濃度的OPG。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，通過Western blot法檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白細胞色素C(cyt.c)的分布、caspase-9和caspase-3的活化水平，通過免疫熒光技術(shù)檢測凋亡相關(guān)因子(AIF)和線粒體核酸內(nèi)切酶G(Endo G)的核轉(zhuǎn)位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPG處理能誘導(dǎo)OCs和OPCs中cyt.c從線粒體釋放到胞漿，激活caspase-9和caspase-3，AIF和Endo G發(fā)生核轉(zhuǎn)位。表明OPG