Fas-FasL信號轉(zhuǎn)導通路在鎘致神經(jīng)細胞凋亡中的作用及NAC的保護效應.pdf

1、鎘(Cd)是環(huán)境中常見的蓄積性重金屬毒物，能造成機體多系統(tǒng)和多器官的損傷。大腦是Cd毒性作用的重要靶器官之一，Cd可以引起血腦屏障功能障礙，進入腦組織引起神經(jīng)元凋亡。死亡受體通路是細胞經(jīng)典凋亡通路之一，F(xiàn)as/FasL信號轉(zhuǎn)導通路是主要死亡受體通路之一。有研究表明，F(xiàn)as/FasL信號轉(zhuǎn)導通路可介導線粒體通路引起細胞凋亡。本課題組前期研究結(jié)果表明，Cd可經(jīng)線粒體通路引起細胞凋亡，但Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路在Cd致神經(jīng)細胞凋亡中的作用

2、及對線粒體通路調(diào)控機制尚未闡明。本研究以原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和PC-12細胞為模型，通過體外試驗探討了Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路在Cd誘導神經(jīng)細胞凋亡中的作用及對線粒體凋亡通路的調(diào)控機制，并研究了N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)在上述過程中的保護作用。
　　1.Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路在鎘致神經(jīng)細胞凋亡中的作用
　　為研究Cd對神經(jīng)細胞Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路的影響，本試驗以原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和PC-12細胞

3、為模型，用不同濃度（0、5、10、20μmol/L）醋酸鎘(CdAc2)處理原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和PC-12細胞不同時間(0、6、12、24 h)，western blot檢測Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)蛋白Fas、FasL、FADD和cleaved caspase-8的表達。結(jié)果表明，隨著Cd劑量的增加，F(xiàn)as、FasL、FADD和cleaved caspase-8的表達量顯著或極顯著高于對照組(p＜0.05或p＜0.01);隨

4、著Cd處理時間的增加，F(xiàn)as、FasL、FADD和cleaved caspase-8的表達量均顯著或極顯著高于對照組(p＜0.05或p＜0.01)。
　　為研究Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路在鎘致神經(jīng)細胞凋亡中的作用，用10μmol/L CdAc2與40μmol/L Z-IETD-FMK（caspase-8特異性抑制劑）或40 mg/L Anti-FasL（FasL中和抗體）單獨及聯(lián)合處理原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和PC-12細胞24

5、h，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染，利用流式細胞術(shù)檢測凋亡率;hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)學變化;AnnexinⅤ-FITC染色，熒光顯微鏡觀察AnnexinⅤ-FITC陽性細胞。結(jié)果表明，Z-IETD-FMK能極顯著抑制Cd引起的細胞核固縮、濃染、碎裂及軸突、樹突神經(jīng)網(wǎng)絡消失等典型的凋亡形態(tài)變化并降低凋亡率(p＜0.01)。Anti-FasL可極顯著抑制Cd所致的細胞凋亡率升高(p＜0.01)。說明F

6、as/FasL信號轉(zhuǎn)導通路在Cd誘導的神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　2.Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路在鎘致神經(jīng)細胞凋亡線粒體通路中的作用
　　為研究Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路在Cd誘導神經(jīng)細胞凋亡線粒體通路中的作用，10μmol/L CdAc2和40μmol/L Z-IETD-FMK或40 mg/L Anti-FasL單獨及聯(lián)合處理原代大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元或PC-12細胞24 h。western blot檢測線粒體凋亡通

7、路相關(guān)蛋白，如cyt c釋放，BID、caspase-9、caspase-3和PARP活化水平及Bax和Bcl-2表達變化;流式細胞術(shù)結(jié)合熒光探針檢測線粒體膜電位（ΔΨm）變化。結(jié)果表明，Z-IETD-FMK可以阻斷Cd引起的ΔΨm下降，線粒體內(nèi)cyt c釋放，BID、caspase-9、caspase-3和PARP的活化及Bcl-2/Bax的降低(p＜0.01或p＜0.05);Anti-FasL可以極顯著抑制線粒體通路相關(guān)蛋白casp

8、ase-9、caspase-3和PARP的活化(p＜0.01)。說明Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路的激活參與調(diào)控Cd誘導的神經(jīng)細胞凋亡線粒體通路。
　　3.NAC在鎘誘導神經(jīng)細胞凋亡Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路中的保護作用
　　為研究NAC在Cd誘導神經(jīng)細胞凋亡Fas/FasL信號轉(zhuǎn)導通路凋亡中的保護作用，本研究用10μmol/L CdAc2與100μmol/L NAC單獨或聯(lián)合處理PC-12細胞24 h。流式細胞術(shù)和Hoch