Fas-FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在PBDE-47致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是一種目前受到全球關(guān)注的新型持久性有機(jī)污染物（persistant organic pollutant，POPs），因其具有阻燃效率高、熱穩(wěn)定性好、對(duì)材料性能影響小、添加量少和價(jià)格便宜等諸多優(yōu)點(diǎn)，PBDEs 作為多氯聯(lián)苯（polychlorrinated biphenyls，PCBs）的替代物廣泛應(yīng)用于電子電器設(shè)備、自動(dòng)控制設(shè)備、建筑材料、家具和紡織品

2、等商業(yè)化產(chǎn)品中。20 世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)環(huán)境中存在PBDEs 污染，隨后的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)PBDEs 廣泛存在于空氣、水、土壤、各種沉淀物以及野生動(dòng)物、魚(yú)類、家禽和人類，而且其暴露水平呈逐年升高的趨勢(shì)。近年來(lái)，大量體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PBDEs 可對(duì)人體健康造成多種危害，包括神經(jīng)毒性、肝臟毒性、生殖毒性、致癌作用及內(nèi)分泌干擾作用等。動(dòng)物試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在鼠大腦發(fā)育關(guān)鍵期暴露低劑量的PBDEs 可導(dǎo)致成年鼠腦功能紊亂，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能缺損和

3、自主行為紊亂，且隨年齡的增長(zhǎng)而癥狀加重，此外，母源性暴露PBDEs 可導(dǎo)致仔鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少且形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常和學(xué)習(xí)記憶功能障礙。因此，目前PBDEs的神經(jīng)發(fā)育毒性越來(lái)越受到人們的關(guān)注。然而，PBDEs神經(jīng)毒性的研究工作仍處于起步階段，多集中于學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)行為等神經(jīng)毒效應(yīng)方面，而對(duì)PBDEs 神經(jīng)毒作用機(jī)制方面的研究涉及較少且不明確，因此，針對(duì)PBDEs神經(jīng)毒作用的機(jī)制展開(kāi)研究，將有利于我們深層次地認(rèn)識(shí)P

4、BDEs 神經(jīng)毒性特點(diǎn)，為日后預(yù)防和控制PBDEs的神經(jīng)毒作用提供理論依據(jù)。
　　 細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞動(dòng)物中的高度進(jìn)化保守途徑，在胚胎發(fā)育和維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡中有十分重要的作用，細(xì)胞凋亡過(guò)程的異常與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展存在密切的聯(lián)系，而且與許多外源化合物的毒性作用有重要關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，PBDEs同系物PBDE-47 可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的海馬細(xì)胞和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡；此外，Madia等實(shí)驗(yàn)

5、研究發(fā)現(xiàn)PBDE-99 可引起人腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PBDE-47 誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡與caspase-3、caspase-12、細(xì)胞色素C和DAPK mRNA表達(dá)水平升高有關(guān)，表明PBDE-47 可能通過(guò)三條經(jīng)典凋亡途徑（線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和死亡受體等途徑）誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，但具體哪條通路是PBDE-47 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑及其作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。
　　 Fas/FasL 信

6、號(hào)通路是一種典型的細(xì)胞凋亡死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且作用機(jī)制目前比較明確。近年來(lái)研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)普遍表達(dá)Fas和FasL，且在多種神經(jīng)性疾病中其表達(dá)明顯升高，提示Fas/FasL 系統(tǒng)在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。目前，關(guān)于Fas/FasL信號(hào)通路在PBDEs 神經(jīng)毒性中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 基于上述理由，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞接觸不同劑量的PBDE-47，觀察PBDE-47 對(duì)細(xì)胞凋亡率、caspase-3、Fas

7、、FasL、caspase-8基因和蛋白表達(dá)水平的影響，從而探討Fas/FasL 信號(hào)通路在PBDE-47 致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 本研究主要由以下二部分組成第一部分 PBDE-47 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡、Fas、FasL、procaspase-8、procaspase-3蛋白和caspase-3、Fas mRNA表達(dá)水平的影響
　　 目的：探討PBDE-47對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率、Fas、Fa

8、sL、procaspase-8、procaspase-3蛋白和caspase-3、Fas mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞暴露于不同濃度的PBDE-47（1、5、10 μmol/L），以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑對(duì)照組，染毒24 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、Fas、FasL、procaspase-8、procaspase-3 蛋白和cas

9、pase-3、Fas mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：10 μmol/L PBDE-47 染毒組細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率明顯高于對(duì)照組、1、5μmol/L PBDE-47 染毒組（P﹤0.05）；與對(duì)照組相比，各染毒組procaspase-3 蛋白表達(dá)均明顯下降（P<0.05）；而各染毒組Fas和procaspase-8 蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；1 μmol/L PBDE-47 染毒組FasL

10、 蛋白與對(duì)照組相比表達(dá)升高（P<0.05），但5、10 μmol/L PBDE-47 染毒組FasL 蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與對(duì)照組相比，各染毒組caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯升高（P<0.05）；而各染毒組Fas mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。
　　 結(jié)論：一定劑量的PBDE-47 可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，引起caspase-3 mRNA表達(dá)升高和pr

11、ocaspase-3 蛋白表達(dá)下降，然而Fas、FasL、procaspase-8 蛋白和Fas mRNA表達(dá)卻沒(méi)有變化。
　　 第二部分 Fas 受體拮抗劑ZB4 對(duì)PBDE-47 致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和procaspase-3蛋白表達(dá)的影響
　　 目的：探討Fas 受體拮抗劑ZB4 對(duì)PBDE-47 致細(xì)胞凋亡和procaspase-3 蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞暴露于10

12、 μmol/L PBDE-47和/或Fas 受體拮抗劑ZB4，DMSO 為溶劑對(duì)照組，染毒24 h后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和procaspase-3 蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：Fas 受體拮抗劑ZB4 單獨(dú)暴露對(duì)細(xì)胞凋亡率和procaspase-3 蛋白表達(dá)沒(méi)有影響（P﹥0.05）；與PBDE-47 單獨(dú)染毒組相比，ZB4與PBDE-47 聯(lián)合染毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率和procaspase-3 蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化（P﹥0.0