山羊類胚胎干細胞和PGCs的培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、為摸索山羊胚胎干細胞體外培養(yǎng)條件，本實驗從胚胎來源、接種方法、飼養(yǎng)層、包被條件、生長因子等方面對影響山羊胚胎干細胞的分離、培養(yǎng)的因素進行了研究，并探索了山羊PGCs的體外培養(yǎng)條件，最后對胚胎干細胞和PGCs進行了鑒定。
　　 1．通過超數(shù)排卵、體外受精、核移植方法獲取囊胚。將體內(nèi)獲取的山羊囊胚切半或將全胚接種到山羊胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層、胎牛肝臟成纖維細胞飼養(yǎng)層和小鼠胚胎原代成纖維細胞飼養(yǎng)層細胞上，比較貼壁率和傳代次數(shù)后發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)層

2、細胞和胚胎處理方法對山羊ICM貼壁和傳代培養(yǎng)影響均顯著，切半的山羊體內(nèi)發(fā)育的囊胚在小鼠胚胎原代成纖維細胞上貼壁率最高為55．6％，可以在體外傳至6代，而在山羊胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上孵化的全胚貼壁率最低為10％，體外僅傳2代。
　　 2．分別采用高糖DMEM及低糖DMEM／F12干細胞培養(yǎng)液在小鼠胚胎原代飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)切半的體外發(fā)育囊胚，待囊胚貼壁后用玻璃針剝離內(nèi)細胞團，酶消化后傳代培養(yǎng)。結果表明；低糖DMEM／F12更適宜于山

3、羊ICM的增殖與克隆形成，ICM在低糖培養(yǎng)液中貼壁率為35．7％，可傳5代，在高糖培養(yǎng)液中貼壁率為26．3％，可傳3代，差異顯著。
　　 3．為比較明膠和ECM對山羊類胚胎干細胞貼壁和培養(yǎng)的影響，將切半的體外發(fā)育的胚胎接種到小鼠胎兒原代成纖維細胞飼養(yǎng)層上，用低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)在明膠包被的培養(yǎng)皿上ICM貼壁率為35．7％，在ECM包被的培養(yǎng)皿上ICM貼壁率稍高，為40％，均可傳5代，差異不顯著。本實驗比較了體外發(fā)育的囊胚和克

4、隆囊胚的貼壁率并傳代培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)：在ECM包被的培養(yǎng)皿、小鼠胚胎原代成纖維細胞飼養(yǎng)層上，低糖培養(yǎng)的條件下，核重編程囊胚ICM的貼壁率為25％，最高傳2代，體外發(fā)育的囊胚ICM貼壁率為40％，最高傳5代，差異極顯著。
　　 4將內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒的原始生殖細胞(PGCs)與生殖嵴周圍細胞共同分離，在三種培養(yǎng)體系中傳代培養(yǎng)，結果表明：未添加任何因子的A培養(yǎng)體系僅能傳1代，僅添加LIF及Insulin的B培養(yǎng)體系可以傳至4代，添加L

5、IF，Insulin及優(yōu)質胎牛血清DMEM／F12的以C組培養(yǎng)體系可以傳至9代。
　　 5對所分離的山羊類胚胎干細胞和PGCs細胞進行形態(tài)學分析、盯一PCR鑒定、AKP染色及免疫熒光檢測，結果發(fā)現(xiàn)：山羊類胚胎干細胞和PGCs細胞可以形成類似鳥巢狀的集落，細胞界限不清，核較大，易于周圍飼養(yǎng)層細胞區(qū)別，AKP鑒定為陽性，RT-PCR檢測β- actin、hTERT、GAPDH、Nanog、Oct3／4為陽性，免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)0ct3