小鼠ntES（核移植胚胎干細胞）系的建立與鑒定人ES（胚胎干細胞）系建立的探索.pdf

1、治療性克隆(therapeuticcloning)是胚胎干細胞技術(shù)(embryonicstemcell，EScell)與核移植(nucleartransfer)技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生的不以生殖為目的新技術(shù)，該項技術(shù)使許多目前醫(yī)學(xué)上沒有有效治療方案的疾病重新獲得治愈的可能。 本研究擬先通過小鼠ES細胞的培養(yǎng)及核移植顯微操作技術(shù)的練習(xí)，建立小鼠核移植后胚胎干細胞(nucleartransferembryonicstemcell，ntESce

2、ll)，再進一步探索人的ES細胞的培養(yǎng)及鑒定，來源于IVF低質(zhì)量廢棄胚胎的人ES細胞系建系，為將來治療性克隆試驗的開展建立試驗基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容包括一下兩個部分：第一部分小鼠ntES細胞的建立及鑒定第一節(jié)不同品系小鼠ES細胞系的建立與鑒定研究目的1探索建立小鼠ES細胞建系的有效方法。 2對建立的ES細胞系進行鑒定，嵌合體小鼠的獲得。 方法1建立小鼠的ES培養(yǎng)體系1.1MEF飼養(yǎng)層的制備取孕12.5～13.5d的KM

3、孕胎鼠，制備MEF，10μg/ml絲裂霉素C作用2-3小時后，重新接種制作飼養(yǎng)層。 1.2小鼠囊胚的獲取采用兩種方式獲取囊胚：(1)dpc3.5-4.5沖洗子宮獲取囊胚。(2)dpc2.5天沖洗輸卵管收集卵裂球，卵裂球體外培養(yǎng)獲取囊胚。 結(jié)果1胚胎的收集與培養(yǎng)dpc2.5沖洗輸卵管取卵裂球體外培養(yǎng)的方法較dpc3.5沖洗子宮的方法獲得的囊胚數(shù)量增多，存在統(tǒng)計學(xué)差異。 2ICM的分離傳代。ICM原代培養(yǎng)4-5天后挑

4、出，重新種植到飼養(yǎng)層上過夜再消化傳代的方式，有助于建立不同品系的小鼠ES細胞系。 3小鼠ES系的建立獲得了來自BALB/C，C57BL/6，B6D2F1(C57BL/6*DBA/2)，129/SV*DBA/2等4不同品系小鼠的10個株ES細胞。根據(jù)其小鼠品系的不同來源分別命名未mES-BALB/C-1，mES-BALB/C-2，mES-C57BL/6-1，mES-C57BL/6-2，mES-C57BL/6-3，mES-B6D2F

5、1-1，mES-B6D2F1-2，mES-B6D2F1-3，mES-B6D2F1-4，mES-129/SV*DBA/2-1。 結(jié)論1、dpc2.5沖洗輸卵管取卵裂球體外培養(yǎng)的方法較dpc3.5沖洗子宮的方法獲得的囊胚數(shù)量增多。 2、適合的ICM分離時機與方法的采用有助于提高mES的建系率。原代ICM挑出重新種植飼養(yǎng)層培養(yǎng)過夜再消化傳代的方法，有助于ICM的進一步擴增，并且可以去除原代ICM周圍的滋養(yǎng)層細胞及部分分化的細胞

6、。 3、本研究獲得的10株小鼠ES細胞，具有正常核型，有自我更新的能力，有體內(nèi)、體外全能分化能力，生殖系嵌合能力檢測中。 第二節(jié)小鼠ntES細胞系的建立與鑒定研究目的利用piezo裝置Hoffman目鏡下進行直視下取出小鼠M-Ⅱ期卵母細胞的紡錘體，顆粒細胞供核胞質(zhì)內(nèi)注射，獲得重構(gòu)卵，體外激活培養(yǎng)，比較添加TSA激活與傳統(tǒng)的Srcl2、CytochalasinB激活法囊胚發(fā)育率的不同，利用重構(gòu)卵囊胚，進行胚胎干細胞培養(yǎng)，對

7、獲得的ntES細胞進行相關(guān)的鑒定 方法1利用piezo操作系統(tǒng)對B6D2F1小鼠M-Ⅱ卵母細胞進行去核，顆粒細胞作為供核胞質(zhì)內(nèi)注射，獲得重構(gòu)卵。 2卵母細胞的去核效果分析隨機抽取去核后的卵母細胞2.1H33342染色觀察結(jié)果，5μg/ml避光染色10分鐘，UV鏡下觀察，細胞核著深藍色熒光。。 2.2Spindleview軟件分析觀察去核效果，細胞核部位可以見到強光閃爍。3重構(gòu)卵的激活 隨機將重構(gòu)卵分為2組

8、，按不同方案激活3.1無TSA激活組：10mmol/LSrCl2，5μg/ml的CytochalasinB的Ca2+freeCZB6小時，轉(zhuǎn)入KSOM培養(yǎng)。 3.2TSA激活組：10mmol/LSrCl2，5μg/ml的CytochalasinB，5nMTSA的Ca2+freeCZB6小時，5nMTSA的Ca2+freeCZB4小時，轉(zhuǎn)入KSOM培養(yǎng)。 激活處理6h，以形成原核為標(biāo)志。4利用重構(gòu)卵發(fā)育的囊胚，進行ntES

9、細胞的培養(yǎng)、鑒定。 方法同第一節(jié)結(jié)果1利用piezo操作系統(tǒng)對小鼠M-Ⅱ卵母細胞的去核效果分析。H33342染色，spindleview軟件分析觀察去核成功率100％。 2添加TSA激活與無TSA激活激活率的比較。激活過程中添加TSA(5nM)能有效的提高重構(gòu)卵的囊胚發(fā)育率，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3小鼠ntES細胞系的建系獲得一株小鼠ntES細胞系，命名為mntES-B6D2F1-1。重構(gòu)卵ICM的貼壁率，ES細

10、胞建系率明顯低于相同品系的正常受精卵(B6D2F1)，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義 4對所獲得的mntES-B6D2F1-1鑒定該細胞系具有典型的ES細胞生長形態(tài)特征，核型正常40，XX，正常核型率75％，AKP染色陽性，ES細胞表面抗原檢測、分化能力的檢測SSEA-1陽性，SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81陰性，具有體外分化成為三個胚層組織的能力。 結(jié)論1利用piezo壓電操作系統(tǒng)能迅速有效的去除M-Ⅱ期的小鼠紡錘

11、體。 2重構(gòu)卵的囊胚進行ES細胞的培養(yǎng)，囊胚貼壁率及ES細胞建系率明顯低于正常的囊胚。 3重構(gòu)卵激活培養(yǎng)過程中添加5nM的TSA能明顯提高囊胚發(fā)育率。 4獲得1個ntES細胞系，命名為mntES-B6D2F1-1，核型：40，XX，鑒定符合ES細胞的標(biāo)準(zhǔn)。 第二部分人胚胎干細胞的建系的探索第一節(jié)HES-4細胞系的培養(yǎng)與鑒定，同源飼養(yǎng)層培養(yǎng)的研究。研究目的通過Havarduniversity贈送的hES-4

12、細胞株在本實驗室的培養(yǎng)傳代，對該細胞株進行相關(guān)鑒定，掌握人ES細胞培養(yǎng)的方法，探索人ES細胞的同源飼養(yǎng)層培養(yǎng)。 材料與方法1hES-4細胞系：由Havarduniversity贈送。 2hES-4細胞系的鑒定對獲得的hES-4細胞進行生長行為及形態(tài)特征、核型、堿性磷酸酶活性、ES細胞表面抗原、分化能力的鑒定。 3人胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)取孕8-12周的流產(chǎn)胎兒的胚胎組織，分離胚胎成纖維細胞，制作飼養(yǎng)層。 4

13、人兒童包皮成纖維細胞的培養(yǎng)健康男孩的包皮切除術(shù)后的包皮組織，分離成纖維細胞制作飼養(yǎng)層。 5STR位點個體識別 結(jié)果1hES-4的生長情況。解凍后細胞生長穩(wěn)定，可以觀察到典型的邊界清晰的克隆形態(tài)，扁平，克隆內(nèi)細胞呈小圓形，邊界清楚，核仁明顯，胞核比例大。機械切割及胰酶消化傳代均能有效保持該細胞系的體外生長。能進行冷凍復(fù)蘇。到目前為止，這些細胞系在體外已經(jīng)分別培養(yǎng)80天，培養(yǎng)代數(shù)由贈送初期的24代傳到45代。 2hE

14、S-4在人胚胎成纖維細胞及人包皮細胞飼養(yǎng)層上的生長情況人胚胎成纖維細胞及人包皮細胞飼養(yǎng)層均能有效支持該細胞系的生長，傳代穩(wěn)定，在本實驗室的利用此兩種飼養(yǎng)層分別傳代已經(jīng)超過10代，克隆生長典型，保持為分化狀態(tài)。 3hES-4細胞系的鑒定核型：46，XY/46，XYinv9，15(q22，q26)，嵌合體核型(21∶10)，AKP陽性，SSEA-1陰性，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81陽性，體外懸浮培養(yǎng)能形成擬胚體，

15、擬胚體貼壁生長能分化成為上皮樣組織，暫時未進行組織切片檢查。 4STR(微衛(wèi)星序列)個體識別 結(jié)論1由Harvarduniversity贈送的hES-4在本試驗室能穩(wěn)定生長傳代，解凍復(fù)蘇。初步鑒定符合hES細胞標(biāo)準(zhǔn)。 2本實驗室分離培養(yǎng)的人胚胎成纖維細胞與包皮成纖維細胞作為飼養(yǎng)層能支持hES-4的穩(wěn)定生長傳代，有效維持細胞的不分化狀態(tài)，保持全能分化的能力。 第二節(jié)人胚胎干細胞建系的探索研究目的利用IVF廢

16、棄的低質(zhì)量胚胎外培養(yǎng)，進行人ES細胞建系研究。 方法1收集本院IVF中心適宜進行子宮移植或冷凍的低質(zhì)量的胚胎。Ⅲ-Ⅳ級胚胎，或者d3卵裂球數(shù)目小于4的低質(zhì)量胚胎。志愿者在知情同意的情況下為醫(yī)學(xué)研究無償捐獻的胚胎。 2采用機械法分離ICM。 結(jié)果1胚胎的收集及囊胚的培養(yǎng)本試驗共收集d3的廢棄胚胎枚44，獲得囊胚9枚，囊胚形成率15.9％，ICM為A級的囊胚1枚。志愿者為醫(yī)學(xué)研究進行供卵，獲得囊胚4枚，ICM為A級的

17、囊胚2枚。 2原代克隆生長情況IVF廢棄胚胎：囊胚9枚，機械法分離共獲得ICM7個，原代種植貼壁生長3個，貼壁率為42.2％。 志愿者囊胚：囊胚4枚，機械法分離共獲得ICM4個，原代種植貼壁生長3個，貼壁率為75％。 3hES的傳代由于本部分研究開始時間較晚，由志愿者供卵獲得的囊胚，3個ICM貼壁，均為機械傳代4代以后，細胞沒有擴增殖，死亡，未能建系。 目前來自IVF廢棄胚胎3個ICM正在進行原代或者初次