還原響應(yīng)型糖脂嫁接物膠束序貫遞釋siRNA與阿霉素的克服腫瘤耐藥研究.pdf

1、腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一，外排蛋白P-糖蛋白(P-gp)的高表達(dá)是腫瘤耐藥細(xì)胞的重要特征，耐藥細(xì)胞的P-gp可將化療藥物如阿霉素等外排，導(dǎo)致化療失敗。研究表明，siRNA可沉默MDR1基因，實(shí)現(xiàn)P-gp表達(dá)的下調(diào)，從而提高耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。本研究采用還原響應(yīng)型糖脂納米載體(CSO-ss-SA)序貫遞釋siRNA及DOX，siRNA下調(diào)P-gp濃度近最低點(diǎn)，實(shí)施序

2、貫給藥，可得到最優(yōu)的給藥系統(tǒng)藥物療效。
　　采用兩步酰胺反應(yīng)法，合成還原響應(yīng)型糖脂嫁接物CSO-ss-SA。核磁共振氫譜法確證嫁接物結(jié)構(gòu)。三硝基苯磺酸法測(cè)定氨基取代度8.12±1.08％。CSO-ss-SA在水中自聚集，可形成類球形且分布均勻膠束。臨界膠束濃度38.9μg/mL。膠束數(shù)均粒徑及表面電位分別為79.9±3.7nm及23.3±1.7mV。
　　CSO-ss-SA膠束通過靜電作用密接siRNA，形成CSO-ss-S

3、A/siRNA復(fù)合物。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)及酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)合物N/P=150時(shí)，CSO-ss-SA可有效密接、保護(hù)siRNA。復(fù)合物數(shù)均粒徑及表面電位分別為39.6±3.9nm及10.5±0.9mV。體外釋放研究表明，復(fù)合物在10mM和0mM谷胱甘肽(Glutathione，GSH)介質(zhì)中，12h累計(jì)釋放量分別為71.6％，28.9％，在10mM谷胱甘肽介質(zhì)中的釋放速率明顯快于在無谷胱甘肽介質(zhì)中。
　　以堿基阿霉素為模型藥物，透析法制

4、備嫁接物載藥納米粒(CSO-ss-SA/DOX)，載藥納米粒數(shù)均粒徑65.7±2.2nm，表面電位13.9±0.8mV。當(dāng)阿霉素投藥量為10％時(shí)，載藥納米粒的包封率和載藥量分別為67.4±3.0％和6.39±0.26％。體外釋放研究表明，在GSH濃度為10mM介質(zhì)中，載藥納米粒具有快速釋藥行為，釋放速率明顯快于其在0mM GSH介質(zhì)中。
　　以MCF-7/ADR為模型細(xì)胞。細(xì)胞攝取結(jié)果顯示，CSO-ss-SA/siRNA的內(nèi)化過程

5、呈時(shí)間依賴性，且攝取速率較快，能有效從內(nèi)溶酶體中逃逸。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time-PCR)測(cè)定MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)MDR1基因表達(dá)，結(jié)果顯示，MCF-7/ADR細(xì)胞與CSO-ss-SA/siRNA復(fù)合物共孵育48h，細(xì)胞內(nèi)MDR1基因表達(dá)下調(diào)至40.8％，優(yōu)于陽性對(duì)照的51.2％。CSO-ss-SA/siRNA與MCF-7/ADR細(xì)胞共孵育1～7d，P-gp表達(dá)量先逐漸下降，后逐漸恢復(fù)至正常水平，在共孵育3d時(shí)，P-gp

6、表達(dá)量最低。共孵育1～3d，P-gp表達(dá)量逐漸下降，表明siRNA誘導(dǎo)的MDR1基因表達(dá)下降，有一個(gè)時(shí)間依賴過程。共孵育4～7d，P-gp表達(dá)量逐漸升高，表明siRNA作用后MDR1基因功能恢復(fù)。
　　CSO-ss-SA/siRNA與MCF-7/ADR細(xì)胞共孵育不同的時(shí)間，再繼續(xù)與CSO-ss-SA/DOX共孵育4h序貫給藥，結(jié)果顯示，當(dāng)CSO-ss-SA/siRNA與MCF-7/ADR細(xì)胞共孵育3d，測(cè)得的P-gp濃度最低，MC

7、F-7/ADR細(xì)胞對(duì)CSO-ss-SA/DOX外排最弱。選擇siRNA下調(diào)P-gp近最低點(diǎn)給藥，可得到最佳的藥物療效。CSO-ss-SA/siRNA與CSO-ss-SA/DOX序貫給藥，較CSO-ss-SA/DOX直接給藥藥效提高了2.3倍。胞內(nèi)ATP濃度變化結(jié)果表明，CSO-ss-SA/DOX經(jīng)內(nèi)吞途徑攝取，消耗了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ATP，抑制了P-gp的外排活性。納米給藥系統(tǒng)具有降低P-gp濃度及活性，減少DOX外排的作用，可實(shí)現(xiàn)克服腫瘤