阿霉素納米制劑克服腫瘤多藥耐藥作用的研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因，也是化療介入腫瘤治療以來(lái)一直懸而未決的重要問題?？朔﨧DR的策略主要包括化療增敏劑如維拉帕米等的開發(fā)，腫瘤藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，生物技術(shù)相關(guān)的逆轉(zhuǎn)方法如基因治療等，這些策略均存在一定不足。藥物載體作為一種新型的MDR逆轉(zhuǎn)策略，既可提高化療藥物作用的敏感性，又可不增加化療藥物對(duì)正常組織的毒副作用，還可突破抗腫瘤藥物的劑量限制，可有

2、效克服上述克服MDR策略的不足而受到較大關(guān)注。 本論文分別制備了阿霉素(doxorubicin，DOX)脂質(zhì)體、阿霉素固體脂質(zhì)納米粒、阿霉素非離子型表面活性劑囊泡等三種納米制劑，并分別用非離子型表面活性劑、陽(yáng)離子材料等修飾脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒，同時(shí)將脂質(zhì)體和維拉帕米聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)阿霉素的細(xì)胞積聚及其胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)特征，細(xì)胞攝取、外排機(jī)制和克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用的可能機(jī)制進(jìn)行了探討，同時(shí)研究了PluronicP85修飾阿霉素脂質(zhì)體的

3、小鼠藥代藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)以及阿霉素非離子型表面活性劑囊泡的小鼠藥效學(xué)。 論文首先建立了耐藥細(xì)胞模型和分析測(cè)定方法。結(jié)果顯示K562/DOX細(xì)胞P-gp高表達(dá)，對(duì)阿霉素耐藥指數(shù)達(dá)107.50，而維拉帕米(Ver)可部分逆轉(zhuǎn)耐藥性。K562/DOX細(xì)胞可以作為以阿霉素為模型藥的納米制劑克服腫瘤細(xì)胞耐藥作用及機(jī)理研究的細(xì)胞模型。以熒光分光光度計(jì)法測(cè)定DOX的濃度，DOX濃度在10～1000ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9

4、998；該方法日內(nèi)、日間精密度、回收率符合測(cè)定要求。并通過(guò)在測(cè)定過(guò)程添加0.1％十二烷基硫酸鈉孵育30min，有效地解決了阿霉素測(cè)定過(guò)程的熒光淬滅。 脂質(zhì)體可部分克服腫瘤多藥耐藥作用。首先采用硫酸銨梯度法制備了阿霉素脂質(zhì)體，藥物穩(wěn)定，滲漏少。K562/DOX細(xì)胞攝取結(jié)果顯示，阿霉素脂質(zhì)體(DOX-L)較同濃度的溶液(DOX-I)有更多被耐藥細(xì)胞攝取。而耐藥細(xì)胞外排阿霉素脂質(zhì)體較溶液緩慢，說(shuō)明阿霉素脂質(zhì)體具有延緩藥物外排的作用。藥

5、物敏感試驗(yàn)(MTT)檢測(cè)脂質(zhì)體的耐藥指數(shù)降低為3.30，說(shuō)明阿霉素脂質(zhì)體可部分克服多藥耐藥。低溫和內(nèi)吞抑制劑(疊氮鈉、甘露醇和氯喹)均顯著降低K562/DOX細(xì)胞內(nèi)DOX的積聚，說(shuō)明耐藥細(xì)胞攝取脂質(zhì)體是通過(guò)能量依賴性的內(nèi)吞方式。 為了進(jìn)一步了解DOX的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及其DOX在亞細(xì)胞器的分布，我們采用HPLC建立了細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器(細(xì)胞核)的含量測(cè)定方法。DOX-L和DOX-I在亞細(xì)胞器的分布結(jié)果顯示，與對(duì)照DOX-I相比，相同藥物量

6、的DOX-L與細(xì)胞孵育后，能顯著提高細(xì)胞核內(nèi)藥物量。而且脂質(zhì)體減慢消除速率，延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)藥物滯留時(shí)間，改變藥物在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)力學(xué)特征和分布，提高了細(xì)胞核內(nèi)藥物量；說(shuō)明阿霉素脂質(zhì)體有趨核分布的特點(diǎn). 非離子型表面活性劑修飾脂質(zhì)體后，將對(duì)細(xì)胞攝取、外排行為和克服多藥耐藥產(chǎn)生影響。采用非離子型表面活性劑pluronic、Span、Tween和CremophorEL修飾脂質(zhì)體，包封率均達(dá)到90％以上，粒徑與阿霉素脂質(zhì)體相似。脂質(zhì)體滲漏結(jié)果顯

7、示，隨著非離子型表面活性劑HLB值的降低，滲漏加快。對(duì)于同系列的非離子型表面活性劑，2h時(shí)K562/DOX攝取藥物量隨非離子型表面活性劑的HLB值降低，攝取增加.但對(duì)不同系列的表面活性劑修飾的脂質(zhì)體，攝取量除與HLB值相關(guān)外，還可能與表面活性劑的性質(zhì)相關(guān)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示修飾后的細(xì)胞毒作用增加，隨HLB值降低，細(xì)胞毒作用增加，證實(shí)了非離子型表面活性劑修飾的阿霉素脂質(zhì)體可更有效克服多藥耐藥。 陽(yáng)離子脂質(zhì)體可促進(jìn)阿霉素趨核，但可能

8、降低耐藥細(xì)胞攝取藥物量。采用DC-Chol和CTAB制備了陽(yáng)離子脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入細(xì)胞的藥物量較普通脂質(zhì)體有所下降，但細(xì)胞核的藥物量卻和脂質(zhì)體相當(dāng)，細(xì)胞核百分比高于普通脂質(zhì)體。 維拉帕米核阿霉素脂質(zhì)體具有協(xié)同抗多藥耐藥作用。為了評(píng)價(jià)維拉帕米對(duì)阿霉素脂質(zhì)體攝取和外排行為的影響，試制了5種阿霉素制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX脂質(zhì)體與維拉帕米溶液混合液(DOX-L-FV)攝取速率快，2h攝取藥物量最大。而阿霉素和維拉帕米共同包被脂質(zhì)體(DOX-L

9、-LV)攝取速率相對(duì)慢，但達(dá)穩(wěn)態(tài)的時(shí)間延長(zhǎng)，在4h攝取藥物量接近DOX-L-FV。由于DOX-L-LV可降低阿霉素和維拉帕米的心臟毒性，有望被開發(fā)為新劑型。細(xì)胞內(nèi)藥物外排結(jié)果顯示含維拉帕米組明顯減緩了外排速率。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：DOX-L-LV

10、nicP85)在小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。首先建立了小鼠血漿和組織樣品中DOX含量測(cè)定的HPLC方法。體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，DOX-L-PluronicP85可顯著延長(zhǎng)DOX的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高血漿中藥物濃度，其消除半衰期為DOX-I的6.72倍，AUC為DOX-I的6.21倍。DOX-L-PluronicP85可增加DOX在腫瘤內(nèi)的分布，其AUC和峰濃度分別為DOX-I組的4.65和1.44倍。其各器官(包括心、腎、肝、脾、肺、腸)

11、的相對(duì)靶向效率均大于1，心、腎的相對(duì)靶向效率更是10倍以上，說(shuō)明DOX-L-PluronicP85的小鼠心、腎毒性顯著低于DOX-I組(p<0.01)。DOX-L-PluronicP852mg/kg時(shí)其抑瘤率為30.83％，與同劑量的DOX-I抑瘤率相當(dāng)(32.09％)；1mg/Kg和4mg/kg的DOX-L-PluronicP85的抑瘤率分別為28.53％和51.91％，顯示較好的劑量依賴性。DOX-I用藥后體重較對(duì)照組有所降低，而采

12、用DOX-L-PLURONICP85治療，體重較對(duì)照組增加，顯示了DOX-L-PluronicP85毒性低.腫瘤病理切片顯示，DOX-L-PLURONICP85對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用顯著，對(duì)心肌毒性小。 固體脂質(zhì)納米粒(SLN)也可有效克服腫瘤多藥耐藥。通過(guò)陰離子聚合物絡(luò)合法有效地解決了水溶性細(xì)胞毒藥物阿霉素的固體脂質(zhì)納米粒包封率。與阿霉素溶液相比，固體脂質(zhì)納米?？梢燥@著提高細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，說(shuō)明固體脂質(zhì)納米粒具有克服腫瘤細(xì)胞耐藥性

13、的作用，而外排試驗(yàn)說(shuō)明固體脂質(zhì)納米粒可以延緩藥物細(xì)胞內(nèi)消除。我們分別采用PluronicF87、F88和P85三種不同Pluronic制備了DOX-SLN，其粒徑和包封率相似，但細(xì)胞攝取試驗(yàn)顯示DOX-SLN-P85在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞的量比DOX-SLN-F87和DOX-SLN-F88多。這可能由于Pluronic組成不同，導(dǎo)致耐藥細(xì)胞K562/DOX的細(xì)胞膜的流動(dòng)性不同，從而影響SLN進(jìn)入細(xì)胞的量。另外制備了CTAB修飾的DOX-SL

14、N，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子CTAB修飾的SLN具有細(xì)胞核靶向性。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DOX-SLN可部分克服多藥耐藥，低溫和內(nèi)吞抑制試驗(yàn)說(shuō)明細(xì)胞攝取DOX-SLN為通過(guò)能量依賴的內(nèi)吞途徑。 非離子型表面活性劑囊泡具有克服部分腫瘤多藥耐藥的作用。采用薄膜分散法制備了DOX非離子型表面活性劑囊泡(DOX-N)。DOX-N和耐藥細(xì)胞K562/DOX孵育后攝取進(jìn)入細(xì)胞的量顯著高于阿霉素溶液，4h進(jìn)入細(xì)胞的藥物為阿霉素溶液的1.4倍。內(nèi)吞抑制劑和低溫?cái)z取

15、實(shí)驗(yàn)顯示K562/DOX細(xì)胞攝取非離子型表面活性劑囊泡也主要通過(guò)內(nèi)吞途徑。MTT實(shí)驗(yàn)提示DOX-N可部分克服多藥耐藥的機(jī)制可能抑制P-gp表達(dá)采用K562/DOX細(xì)胞嫁接法建立了動(dòng)物耐藥模型，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，DOX-N組與DOX-I組的腫瘤體積相比明顯減小，差異有顯著性。DOX-N組的抑瘤率高達(dá)為67.97％，遠(yuǎn)高于DOX-I組(16.12％)。體外細(xì)胞和在體實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，DOX-N有效克服了多藥耐藥。 本論文的研究，將為這些制劑克服