阿霉素載藥膠束的制備及體外抗腫瘤活性研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康和生命的肺部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中約85％為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。化療是目前腫瘤主要治療手段之一。阿霉素(Doxorubicin，DOX)是目前臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，然而該類藥物毒性較大，長(zhǎng)期應(yīng)用可發(fā)生劑量依賴性的不可逆的心肌病變，骨髓抑制，脫發(fā)，消化道癥狀等，同時(shí)其多藥耐藥性的存在也使其在臨床的應(yīng)用受到一定限制。
　　目前，載體給藥系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體、納米粒和聚合膠束等作為一種新型的MD

2、R逆轉(zhuǎn)策略被認(rèn)為是最有效的途徑，已經(jīng)在臨床上取得了可喜的進(jìn)展。作為載體給藥系統(tǒng)的一員，從兩親性嵌段共聚物發(fā)展而來(lái)聚合物膠束，近十年來(lái)深受青睞。當(dāng)投入到水性介質(zhì)中時(shí)，在體系自由能降低的驅(qū)動(dòng)下，膠束的疏水段自發(fā)聚集在一起形成微粒的內(nèi)核。它既可以作為很多難溶性藥物的微儲(chǔ)庫(kù)，又能避免藥物在生物體內(nèi)環(huán)境中失活。自組裝形成的載藥膠束是熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的體系，具有穩(wěn)定、長(zhǎng)效、安全等許多優(yōu)良的性質(zhì)，使得聚合物膠束成為難溶性藥物理想的輸送系統(tǒng)，且在藥物

3、釋放、基因載體和診斷制劑等很多方面得到廣泛地應(yīng)用。
　　研究目的：
　　本課題以聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，聚己酸內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)和普朗尼克P105為高分子材料，采用溶劑揮發(fā)法制備阿霉素載藥膠束，并對(duì)阿霉素載藥膠束的體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。
　　研究方法：
　　1.采用三種不同的高分子聚合物，聚乙二醇，聚己酸內(nèi)酯和普朗尼克P105，阿霉素為模型藥物，

4、溶劑揮發(fā)法制備阿霉素載藥膠束及空白膠束。共聚物膠束在水中的粒徑分布采用動(dòng)態(tài)光散射粒徑測(cè)定儀(DLS)進(jìn)行測(cè)定。共聚物膠束的形態(tài)通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察，HPLC法測(cè)定阿霉素載藥膠束中阿霉素的含量。
　　2.溴化四氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定阿霉素和阿霉素載藥膠束對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的抑制作用，并通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，來(lái)判別細(xì)胞毒作用的強(qiáng)弱。
　　3.阿霉素具有熒光性，我們利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦研究A549細(xì)胞對(duì)阿霉素和阿

5、霉素載藥膠束的攝取和滯留。
　　4.細(xì)胞吸收阿霉素載藥膠束后，為了更精確觀察藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布，我們分別用Hoechst33342，MitoTracker Deep Red FM及LysoTracker Blue DND-22對(duì)細(xì)胞核、線粒體、溶酶體進(jìn)行染色，采用激光共聚焦顯微鏡分析阿霉素載藥膠束的細(xì)胞核及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的靶向分布。
　　5.通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)阿霉素載藥膠束較阿霉素的放療增敏效應(yīng)。
　　研究結(jié)果：

6、　　1.透射電鏡觀察結(jié)果顯示，阿霉素載藥膠束及空載體膠束，粒子呈球型，顆粒狀，無(wú)粘連。膠束的粒徑多在100-200 nm。高效液相色譜法(high performanceliquid chromatograph，HPLC)測(cè)得樣本在1.11-111μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，從而測(cè)出阿霉素載藥膠束中藥物濃度。
　　2.阿霉素載藥膠束的抗腫瘤活性比普通阿霉素明顯增強(qiáng)?？瞻譖EG-PCL/P105聚合物膠束對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性，說(shuō)

7、明阿霉素載藥膠束是通過(guò)阿霉素，而并非藥物載體起到抗腫瘤的作用。
　　3.流式及激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取及滯留。結(jié)果顯示在阿霉素藥物濃度相同時(shí)，相同作用時(shí)間下，阿霉素載藥膠束比普通阿霉素更容易被細(xì)胞攝取，阿霉素載藥膠束在細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)。
　　4.阿霉素載藥膠束和普通阿霉素的亞細(xì)胞定位大致相同。藥物的紅色熒光和LysoTracker Blue DND-22染色劑的熒光信號(hào)部分重疊，和MitoTracker Deep

8、 Red FM染色劑的熒光信號(hào)完全重疊，和Hoechst33342染色的熒光信號(hào)不重疊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明細(xì)胞吸收阿霉素載藥膠束或者阿霉素后，可以通過(guò)溶酶體途徑轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　5.與單純放療組相比，普通阿霉素或阿霉素載藥膠束聯(lián)合放療組細(xì)胞生存曲線斜率更低。因此，阿霉素與阿霉素載藥膠束都具有放療增敏作用。同時(shí)，與放療聯(lián)合普通阿霉素組相比，放療聯(lián)合阿霉素載藥膠束組對(duì)腫瘤細(xì)胞的放療增敏效應(yīng)更強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　我們采用三種不同的高分

9、子聚合物，聚乙二醇(PEG)，聚己酸內(nèi)酯(PCL)和普朗尼克P105，阿霉素為模型藥物，制備合成了阿霉素載藥膠束。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所制備的納米膠束給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性。MTT結(jié)果證明阿霉素載藥膠束的抗腫瘤活性比普通阿霉素明顯增強(qiáng)而且空白PEG-PCL/P105聚合物膠束對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性;流式細(xì)胞儀及激光共聚焦結(jié)果均表明阿霉素載藥膠束較普通阿霉素更易被細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間延長(zhǎng);采用激光共聚焦手段測(cè)定阿霉素及阿霉素載藥膠束亞細(xì)胞