Tudor-SN蛋白參與細胞周期及細胞增殖調(diào)控的機制研究.pdf

1、研究目的：細胞周期，是一個細胞從上一次分裂發(fā)生，到下一次分裂形成兩個子細胞的過程，它是生命不斷延續(xù)并更新的基礎。細胞通過每個周期的完成，來實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的復制以及平均分配。細胞周期與細胞增殖、細胞分化之間存在著密切的聯(lián)系，它們彼此協(xié)調(diào)，互相控制，共同在多種疾?。ㄓ绕涫悄[瘤）中發(fā)揮重要作用。細胞周期的調(diào)控涉及細胞周期蛋白（cyclins）的時序性表達和降解、細胞周期蛋白依賴性激酶（Cdks）和Cdk抑制蛋白（CdkIs）活性的改變、以及一些

2、相關轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等。Tudor-SN蛋白是一個在多種動、植物細胞和組織中廣泛表達的保守的多功能蛋白，近些年不斷有研究發(fā)現(xiàn)Tudor-SN蛋白參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tudor-SN蛋白可以促進HeLa細胞G1期至S期的周期進程；并且當細胞同步化于G1末期，再向S期釋放時， Tudor-SN蛋白的敲低可以阻止細胞向S期的釋放?？梢?，Tudor-SN蛋白是一個新發(fā)現(xiàn)的參與細胞周期調(diào)控的調(diào)節(jié)因子。但關于Tudor-SN

3、蛋白調(diào)控細胞周期進程的詳細信號通路尚未揭示。課題組的相關研究還顯示，敲低Tudor-SN蛋白的表達可以抑制細胞的增殖活力，并且Tudor-SN蛋白的表達水平與細胞的增殖能力密切相關：在增殖能力旺盛的細胞中表達水平高，在終末分化退出增殖周期的細胞中低表達或不表達，但調(diào)控的原因并不清楚。本課題為解決以上兩個問題，將分為兩部分展開研究，第一部分旨在研究Tudor-SN蛋白調(diào)控細胞周期G1期至 S期進程的具體機制；第二部分將探討不同增殖能力的細

4、胞或組織中Tudor-SN蛋白差異表達的調(diào)控機制。希望通過兩部分的研究，完善Tudor-SN蛋白參與細胞周期及細胞增殖調(diào)控的上游及下游信號通路，并為研究Tudor-SN蛋白通過調(diào)控細胞周期參與細胞的增殖、分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。
　　研究方法：本課題的研究主要分為兩個部分。第一部分研究旨在明確 Tudor-SN蛋白參與細胞周期G1期至S期周期進程調(diào)控的具體機制：1）利用免疫共沉淀（CoIP）技術結合細胞同步化技術明確不

5、同周期時相Tudor-SN蛋白的表達水平及磷酸化修飾情況；2）利用 CoIP及激酶活性抑制等方法明確不同周期時相磷酸化 Tudor-SN蛋白的上游蛋白激酶；3）利用生物信息學預測、點突變技術、流式細胞周期檢測、雙熒光素酶分析技術等明確Tudor-SN蛋白參與細胞周期調(diào)控的磷酸化修飾位點；4）利用雙熒光素酶活性分析技術、WB及PCR實驗驗證Tudor-SN蛋白對S期基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用；5）利用CoIP、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）等方

6、法明確Tudor-SN蛋白調(diào)控S期基因表達的具體方式。第二部分探討不同增殖能力的細胞或組織中 Tudor-SN蛋白差異表達的調(diào)控機制研究：1）利用WB、Realtime PCR、蔗糖密度梯度離心、多聚核糖體分布分析等檢測Tudor-SN蛋白在終末分化心肌細胞中低表達的調(diào)控機制；2）通過DBTSS數(shù)據(jù)庫明確Tudor-SN mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點，并分析其是否具有5’TOP序列；3）利用雙熒光素酶實驗結合抑制劑的使用明確PI3K/ AKT

7、/ mTOR信號通路在腫瘤細胞系（HeLa）及心肌細胞系（H9C2）中對Tudor-SN蛋白及mRNA表達水平的調(diào)控；4）通過 KEGG公共數(shù)據(jù)庫對前期心肌組織芯片的差異基因進行Pathway分析，篩選出與PI3K/ AKT/ mTOR信號傳導通路關系密切的基因，并利用Realtime PCR在出生1天及成年小鼠心肌組織中對芯片結果進行驗證；5）利用流式細胞周期檢測分析Tudor-SN蛋白對PI3K/ AKT/ mTOR信號通路調(diào)控細胞

8、周期的影響。
　　結果：
　　1、Tudor-SN蛋白在不同細胞周期時相的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平不同， G1/S期及 G2/M期 Tudor-SN蛋白的絲/蘇氨酸磷酸化修飾水平高于其他期；而Cdk激酶是磷酸化Tudor-SN蛋白的上游激酶；Ser426/Thr429位點是Tudor-SN蛋白參與細胞周期調(diào)控的關鍵磷酸化位點；Tudor-SN蛋白通過募集組蛋白乙酰化酶（GCN5）至E2F-1轉(zhuǎn)錄復合體，增強E2F-1與下游基

9、因（cyclinA, E2F-1）啟動子的結合能力，促進S期基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而促成細胞G1/S期的轉(zhuǎn)換。
　　2、Tudor-SN在退出細胞周期的終末分化心肌細胞中僅蛋白低表達，mRNA表達并未降低，調(diào)控發(fā)生在翻譯水平；Tudor-SN mRNA含有5’TOP序列，并且其5’TOP序列對基因表達的調(diào)控受PI3K/ AKT/ mTOR信號通路影響；Tudor-SN蛋白的表達受PI3K/ AKT/ mTOR/4EBP信號通路的調(diào)控；

10、成熟小鼠心肌組織中PI3K/ AKT/ mTOR信號通路處于低活性狀態(tài)；Tudor-SN蛋白影響PI3K/ AKT/mTOR信號通路對細胞周期的調(diào)控。
　　結論：
　　1、Tudor-SN蛋白通過增強 E2F-1下游基因的轉(zhuǎn)錄表達，促進細胞完成G1/S周期的轉(zhuǎn)換，在這個過程中，Cdk類激酶是Tudor-SN蛋白的上游激酶，Ser426/Thr429是其參與周期調(diào)控的關鍵磷酸化位點。
　　2、Tudor-SN是一個新發(fā)現(xiàn)