血紅素氧合酶-一氧化碳系統(tǒng)調(diào)節(jié)肝內(nèi)鐵代謝對大鼠肝硬化影響的研究.pdf

1、在我國乙肝高發(fā)，若得不到有效控制，終將進(jìn)展為肝纖維化，甚至肝硬化。肝硬化失代償期患者的5年病死率高達(dá)70％-86％。然而，目前肝硬化的病理生理機(jī)制還未完全清楚，臨床上缺乏有效的抗纖維化藥物。因此，探討肝硬化的發(fā)生機(jī)理，尋求有效的干預(yù)方法迫在眉睫。肝臟、脾臟及骨髓等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)是體內(nèi)主要的儲鐵器官。近年來，多項(xiàng)研究顯示慢性肝病，如非酒精性脂肪肝、肝硬化及肝癌等，存在肝內(nèi)鐵代謝紊亂。肝內(nèi)鐵過度沉積參與了肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，提示鐵在肝臟疾病中

2、的重要作用。Fe2+是血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的降解產(chǎn)物之一，在肝硬化時HO-1表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)e2+生成增多，可能參與肝硬化及其并發(fā)癥形成的病理生理過程。我們前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HO-CO系統(tǒng)在肝纖維到肝硬化不同階段，不同并發(fā)癥及不同臟器發(fā)揮的作用不同。目前，國內(nèi)外主要研究HO-1的抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用機(jī)制，而關(guān)于其產(chǎn)物Fe2+、CO及膽綠素在疾病中發(fā)揮的作用研究較少。此外，鐵在肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用

3、機(jī)制目前還未清楚。臨床上，肝硬化晚期上消化道出血患者，大量多次輸注陳舊紅細(xì)胞可能導(dǎo)致肝內(nèi)鐵沉積;肝硬化晚期脾大脾功能亢進(jìn)，大量紅細(xì)胞被破壞并釋放過多鐵，而且肝臟是重要的儲鐵器官。本研究通過高鐵、去鐵、脾切除、誘導(dǎo)或抑制HO-1表達(dá)來調(diào)節(jié)肝內(nèi)鐵代謝，揭示鐵在肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為治療肝硬化提供新的觀點(diǎn)和思路。
　　 本研究共分三部分。
　　 第一部分干預(yù)肝內(nèi)鐵代謝對大鼠肝硬化影響的研究
　　 目的:通過給鐵

4、或去鐵干預(yù)肝硬化大鼠肝內(nèi)鐵代謝，進(jìn)一步研究鐵在肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠44只，隨機(jī)分成4組:假手術(shù)(Sham)組10只、肝硬化(bile duct ligation，BDL)組10只、高鐵(Fe)組14只，去鐵胺(deferoxamine，DFX)組10只。大鼠肝硬化模型采用膽總管結(jié)扎的方法制備，4周后造模成功并取材。Fe組和DFX組制模方法同BDL組，從造模第一天開始，

5、分別給予腹腔注射右旋糖酐鐵40 mg/mL/kg體重，甲磺酸去鐵胺20 mg/mL/kg體重，3次/周，BDL組給予等量的生理鹽水腹腔注射。4周后，所有大鼠采集靜脈血之后處死，采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)反映肝臟功能;取肝組

6、織，HE染色觀察肝臟的結(jié)構(gòu)改變;測定血清鐵、血清鐵蛋白的含量，原子分光光度計法測定肝內(nèi)鐵含量(Liveriron content，LIC)，采用普魯士藍(lán)染色觀察肝臟鐵沉積的分布情況。免疫組織化學(xué)檢測α肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)及分布;Western-blot方法測定肝內(nèi)轉(zhuǎn)錄生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、α-SMA;RT-PCR的方

7、法檢測大鼠肝臟TGF-β1、α-SMA mRNA的水平，采用試劑盒測定肝組織內(nèi)羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)的含量和肝組織丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。
　　 結(jié)果:4w后BDL大鼠模型成功，膽總管擴(kuò)張明顯。血清生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示:與Sham組相比，BDL組AST、ALT及TBIL均明顯升高(P＜0.01);與BDL組相

8、比，F(xiàn)e組進(jìn)一步升高，而DFX組則明顯降低(P＜0.01)。
　　 HE染色顯示，BDL組肝臟細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤，纖維間隔形成，肝細(xì)胞結(jié)節(jié)樣再生，假小葉形成;Fe組肝細(xì)胞片狀壞死，纖維增生較多，而DFX組肝細(xì)胞較少壞死，纖維增生少，無明顯的假小葉形成。
　　 與Sham組相比，BDL組血清鐵、血清鐵蛋白及肝內(nèi)鐵均顯著增加(229.74±9.72μg/dL vs165.4±10.79μg/dL,P＜0.01;45.94

9、±0.52μg/L vs39.42±0.38μg/L,P＜0.01;440.74±12.58μg/g vs350.15±16.4μg/g，P＜0.01）;與BDL組相比，F(xiàn)e組三者均明顯升高(378.92±35.59μg/dL vs229.74±9.72μg/dL,P＜0.01;53.12±0.65μg/L vs45.94±0.52μg/L,P＜0.01;593.55±6.66μg/g vs440.74±12.58μg/g,P＜0.01

10、)，而DFX組則明顯降低(181.63±4.34μg/dL vs229.74±9.72μg/dL，P＜0.01;42.54±0.33μg/L vs45.94±0.52μg/L,P＜0.01;361.55±21.24μg/g vs440.74±12.58μg/g,P＜0.01)。
　　 與Sham組相比，BDL組大鼠肝內(nèi)TGF-β1及α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.01); Fe組TGF-,B1及α-SMA表達(dá)

11、水平則較BDL組均明顯增加(P＜0.01)，DFX組TGF-β1及α-SMA表達(dá)水平則明顯減少(P＜0.01)。α-SMA免疫組化結(jié)果與其蛋白及基因一致。
　　 與Sham組相比，在BDL組肝內(nèi)SOD水平明顯降低(P＜0.01)，而MDA水平明顯升高(P＜0.01);與BDL組相比，F(xiàn)e組SOD進(jìn)一步降低(P＜0.01)，而MDA則升高明顯(P＜0.01);與BDL組相比，而DFX組SOD明顯升高(P＜0.01)，MDA則明顯降

12、低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)膽汁淤積性肝硬化肝內(nèi)有少量鐵沉積。肝內(nèi)過度鐵沉積可以加重肝硬化，而去鐵治療能減少肝內(nèi)鐵沉積，延緩肝硬化。
　　 第二部分誘導(dǎo)或抑制血紅素氧合酶-1表達(dá)對肝硬化大鼠肝內(nèi)鐵代謝影響機(jī)制的研究
　　 目的:通過誘導(dǎo)或抑制血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)表達(dá)，調(diào)節(jié)其產(chǎn)物鐵在肝硬化大鼠肝內(nèi)的代謝，進(jìn)一步研究HO-1及鐵對肝硬化的影響。
　　

13、方法:成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠42只，隨機(jī)分成4組:假手術(shù)(Sham)組8只、肝硬化(bile duct ligation，BDL)組10只、鋅原卟啉(zinc protoporphyrin，ZnPP)組12只，鈷原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)組12只。大鼠肝硬化模型采用膽總管結(jié)扎的方法制備，4周后造模成功并取材。CoPP組和ZnPP組制模方法同BDL組，從造模第一天開始，分別給予腹腔

14、注射CoPP或ZnPP5mg/kg體重，3次/周，BDL組給予等量的生理鹽水腹腔注射。4周后所有大鼠采血后處死。采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)及血清鐵;采用原子分光光度計法測定肝內(nèi)鐵含量(Liver iron content，

15、LIC)，采用普魯士藍(lán)染色觀察肝臟鐵沉積的分布情況; HE染色觀察肝臟的結(jié)構(gòu)改變，通過免疫組織化學(xué)的方法觀察大鼠肝臟HO-1蛋白的表達(dá)及分布;Western-blot方法測定肝內(nèi)HO-1蛋白的表達(dá)，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(nuclear factor-E2-related factor2，Nrf2); RT-PCR的方法檢測大鼠肝臟HO-1及Nrf2 mRNA的水平。采用ELISA方法測定大鼠血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming

16、 growth factor-β1，TGF-β1)及海帕西啶(Hepcidin);測定肝組織丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。
　　 結(jié)果:血清生化指標(biāo)AST、ALT及TBIL測定結(jié)果顯示:與Sham組相比，BDL組明顯升高(P＜0.01);與BDL組相比，CoPP組進(jìn)一步升高(P＜0.01)，而ZnPP組則明顯降低(P＜0.01)。
　

17、　 肝臟HE染色顯示BDL組大鼠肝臟細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維間隔形成，肝細(xì)胞結(jié)節(jié)樣再生，假小葉形成;CoPP組纖維化評分較BDL增加(P＜0.01)，而ZnPP組評分較低(P＜0.01)。
　　 VG染色顯示BDL組肝內(nèi)Ⅰ型膠原沉積較Sham組明顯增多(P＜0.01)，與BDL組相比，CoPP組Ⅰ型膠原沉有所增加(P＜0.01)，而ZnPP組膠原沉積明顯減少(P＜0.01)。
　　

18、與Sham組相比，BDL組血清TGF-β1濃度明顯升高(P＜0.01);與BDL組相比，CoPP組TGF-β1濃度明顯增加(P＜0.01)，而ZnPP組明顯降低(P＜0.01)。
　　 血漿Hepcidin濃度在BDL組較Sham組明顯降低(292.35±11.81 ng/mlvs366.71±4.66 ng/ml，P＜0.01);與BDL組相比，CoPP組血漿Hepcidin濃度減低更明顯(275.73±10.13ng/ml

19、vs292.35±11.81 ng/ml，P＜0.01)，而ZnPP組濃度明顯升高(315.79±12.0 ng/ml vs292.35±11.81 ng/ml,P＜0.01)。
　　 HO-1及Nrf2蛋白及基因檢測表明:與Sham組相比，BDL組大鼠肝內(nèi)HO-1的蛋白及mRNA的水平明顯升高(P＜0.01); CoPP組HO-1水平較BDL組明顯增加(P＜0.01)，ZnPP組HO-1表達(dá)水平則明顯減少(P＜0.01)。HO

20、-1免疫組化結(jié)果與其蛋白及基因一致。
　　 血清鐵濃度及LIC在BDL組較Sham組升高(229.74±9.72μg/dl vs165.4±10.8μg/dl，P＜0.01);與BDL組相比，二者在CoPP組則明顯升高(2272.14±16.28μg/dlvs229.74±9.7μg/dl，P＜0.01)，而在ZnPP組明顯下降(194.95±4.72μg/dlvs229.74±9.72μg/dl,P＜0.01)。
　　

21、 與Sham組相比，在BDL組SOD水平明顯降低(P＜0.01)，而MDA水平明顯升高(P＜0.01);與BDL組相比，CoPP組SOD進(jìn)一步降低(P＜0.01)，而MDA則升高明顯(P＜0.01);與BDL組相比，而ZnPP組SOD明顯升高(P＜0.01)，MDA則明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:ZnPP抑制HO-1表達(dá)能減少BDL誘導(dǎo)的肝硬化大鼠肝內(nèi)鐵沉積，減輕肝纖維化。Nrf2/Keap1通路可能參與了HO-1表達(dá)

22、及鐵沉積。
　　 第三部分脾切除對肝硬化肝內(nèi)鐵代謝及門脈高壓影響的研究
　　 目的:探討脾切除對肝硬化門脈高壓大鼠血紅素氧合酶/一氧化碳系統(tǒng)(Hemeoxygenase/carbon monoxide，HO/CO)及肝內(nèi)鐵代謝的影響，進(jìn)一步研究脾切除治療肝硬化的機(jī)制。
　　 方法:成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠32只，隨機(jī)分成3組:假手術(shù)(Sham)組10只、肝硬化(bile duct ligati

23、on，BDL)組10只和脾切除(Splenectomy)組12只。大鼠肝硬化模型采用膽總管結(jié)扎的方法制備，2周時Splenectomy組行脾切除。4周后，所有大鼠以生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀測定門靜脈壓力，采集靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin,

24、 TBIL)及血清鐵，采動脈血測定碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，COHb);機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀測定大鼠門靜脈壓力(portal vein pressure，PVP);取肝脾組織，HE染色觀察肝臟的結(jié)構(gòu)改變，VG染色觀察脾臟Ⅰ型膠原含量;原子分光光度計法測定肝內(nèi)鐵含量(Liver iron content，LIC)，采用普魯士藍(lán)染色觀察肝脾鐵沉積的分布情況。ELIAS方法檢測血清中轉(zhuǎn)錄生長因子-β1(transforming

25、growth factor-β1，TGF-β1)水平;Westem-blot方法測定肝內(nèi)HO-1蛋白表達(dá);RT-PCR的方法檢測肝內(nèi)HO-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissueinhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA的表達(dá)水平，測定肝組織內(nèi)羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)的含量。測定

26、肝組織丙二醛(malonaldehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的活性。
　　 結(jié)果:2w脾臟明顯增大，4w后BDL組肝硬化造模成功。與Sham組相比，BDL組AST、ALT及TBIL均明顯升高(P＜0.01)，Splenectomy組三者則較BDL組明顯降低(P＜0.01)。肝臟組織病理學(xué)證實(shí)脾切除能明顯減少肝內(nèi)纖維間隔形成，減少膠原沉積。
　　 與BDL組比較，Splenectomy組H

27、YP明顯降低(153.2±12.4μg/g vs173.4±18.4tg/g，P＜0.01)，血清TGF-β1明顯減少(4.6±0.28 ng/ml vs9.86±0.72 ng/mL，P＜0.01)，PVP明顯降低(10.31±0.98 mmHg vs15.81±1.66 mmHg，P＜0.01)。
　　 BDL組肝內(nèi)HO-1 mRNA和蛋白的水平較Sham組升高(P＜0.01);與BDL組相比，Splenectomy組肝內(nèi)H

28、O-1 mRNA和蛋白的水平明顯降低(P＜0.01)。血COHb水平與HO-1表達(dá)水平一致。肝臟HO-1免疫組化顯示，HO-1主要在肝細(xì)胞及中央靜脈周圍表達(dá)。脾臟HO-1免疫組化顯示，HO-1主要表達(dá)在脾臟紅髓，與Sham組比較，BDL組HO-1表達(dá)增加(P＜0.01)，Splenectomy組2w的脾臟HO-1表達(dá)較BDL組減少(P＜0.01)。
　　 與Sham組相比，BDL組大鼠血清鐵、肝內(nèi)鐵均明顯升高(231.91±7.

29、7μg/dL vs164.87±15.6μg/dL，P＜0.01);而Splenectomy組則較BDL組二者明顯降低(185.15±22.3μg/dL vs231.91±7.7μg/dL，P＜0.01)。普魯士藍(lán)染色顯示，肝內(nèi)鐵主要沉積在巨噬細(xì)胞等。脾臟鐵沉積主要在紅髓。VG染色顯示2w和4w脾臟都有明顯的Ⅰ型膠原沉積。
　　 與Sham組相比，BDL組肝內(nèi)MMP-2及TIMP-1 mRNA水平均明顯升高(P＜0.01);而S