血紅素氧合酶-1-一氧化碳系統(tǒng)預(yù)防兔動(dòng)脈粥樣硬化、頸動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄的研究.pdf

1、研究背景:冠心病(Coronaryheartdisease,CHD)是致死和致殘的主要疾病之一，其病因是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty,PTCA)及支架置入術(shù)是有效和廣泛應(yīng)用的冠心病介入治療手段，然而PTCA術(shù)后再狹窄(Restenosis,RS)是臨床亟待解決的難題。盡管動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄發(fā)生的機(jī)制尚

2、不完全清楚，但氧化損傷、炎癥反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖被認(rèn)為是AS和RS的主要病理特征。近年的研究表明，血紅素氧合酶-—氧化碳-環(huán)一磷酸鳥(niǎo)苷(HO-CO-cGMP)這一新型細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)，涉及許多生理和病理過(guò)程，參與心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。血紅素氧合酶(Hemeoxygenase,HO)是血紅素分解代謝的起始酶和限速酶，HO-1為誘導(dǎo)型，可催化降解細(xì)胞漿中的血紅素產(chǎn)生CO、膽綠素和

3、鐵，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)源性CO在血管生物學(xué)功能調(diào)節(jié)中起著很重要的作用，是心血管系統(tǒng)的細(xì)胞信使，CO與一氧化氮(NO)有相似的心血管作用，能激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(sGC)，使細(xì)胞漿中cGMP水平上升，從而舒張血管平滑肌、抑制血小板聚集和VSMCs增殖；膽綠素進(jìn)一步經(jīng)膽綠素還原酶作用生成膽紅素，膽紅素是一種強(qiáng)的抗氧化劑，能有效地清除活性氧和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化；鐵盡管本身不是抗氧化劑，但能促進(jìn)抗氧化劑鐵蛋白的合成，起到間接的抗氧化

4、作用。 有研究結(jié)果提示HO-1在AS、內(nèi)膜增生及肺動(dòng)脈高壓等病變形成中具有重要的生理和病理作用。然而，在AS與RS形成的不同階段HO-1表達(dá)水平、CO生成量、HO-1/CO系統(tǒng)如何改變?其改變與AS、RS病變程度有何關(guān)系及內(nèi)在聯(lián)系?有關(guān)這些問(wèn)題國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。 胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(Insulin-likegrowthfactor-I,IGF-I)作為一種重要的有絲分裂原，通過(guò)自分泌或旁分泌的機(jī)制刺激和調(diào)節(jié)VSMCs的分

5、裂增殖，有較強(qiáng)的促VSMCs增殖的作用。一些以VSMCs增殖為主要病理改變的疾病，包括AS、內(nèi)皮剝脫及血管成形術(shù)后RS、主動(dòng)脈縮窄造成的高血壓等，均可見(jiàn)到IGF-ImRNA的表達(dá)增加，表明IGF-I參與了AS、RS等的發(fā)生發(fā)展。然而HO-1/CO系統(tǒng)是否對(duì)IGF-I誘導(dǎo)的VSMCs增殖產(chǎn)生影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。 研究目的:1.研究在高膽固醇飲食誘導(dǎo)的AS形成中，主動(dòng)脈壁內(nèi)HO-1表達(dá)及CO生成的變化對(duì)AS進(jìn)程的影響，探討HO-1

6、/CO系統(tǒng)在AS進(jìn)程中的作用及分子機(jī)制；2.研究兔頸動(dòng)脈球囊損傷后RS形成過(guò)程中頸動(dòng)脈壁內(nèi)HO-1表達(dá)及CO生成的變化對(duì)血管重塑的影響，探討HO-1/CO系統(tǒng)在RS形成中的作用及分子機(jī)制；3.研究HO-1/CO系統(tǒng)對(duì)IGF-I誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響及分子機(jī)制，為進(jìn)一步探討內(nèi)源性HO-1/CO系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病中的作用及為這些疾病的臨床防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:1.家兔予以高膽固醇飲食

7、(膽固醇組)以及在高膽固醇飲食的同時(shí)給予腹腔注射HO-1誘導(dǎo)劑氯化血紅素(血紅素組)或HO-1抑制劑鋅原卟啉-9(卟啉鋅組)，分別于實(shí)驗(yàn)4w、8w、12w，采血測(cè)定血脂指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)、血清總膽紅素(TBil)水平，取主動(dòng)脈，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定CO生成量，采用油紅O染色及病理圖像分析軟件檢測(cè)主動(dòng)脈斑塊面積，通過(guò)組織學(xué)技術(shù)觀察主動(dòng)脈病變，通過(guò)透射電子顯微鏡技術(shù)觀察主動(dòng)脈病變的超微結(jié)構(gòu)改變，采用免疫組織化學(xué)(IHC)

8、技術(shù)檢測(cè)HO-1在主動(dòng)脈組織中的定位表達(dá)，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和Westernblot方法檢測(cè)主動(dòng)脈壁內(nèi)HO-1mRNA及HO-1蛋白表達(dá)量。 2.家兔隨機(jī)分為5組：對(duì)照組；膽固醇組；血紅素組；卟啉鋅組；假手術(shù)組。采用高膽固醇飲食加動(dòng)脈損傷的方法制作家兔頸動(dòng)脈球囊損傷后RS模型，同時(shí)進(jìn)行氯化血紅素及鋅原卟啉-9干預(yù)觀察。分別于術(shù)后2w、6w、10w，采血測(cè)定血脂指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)、血

9、清TBil水平，取頸動(dòng)脈，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定CO生成量，通過(guò)組織學(xué)檢查及病理圖像分析軟件檢測(cè)增生內(nèi)膜厚度(I)、中膜厚度(M)及二者比值(I/M)，采用IHC技術(shù)檢測(cè)HO-1在頸動(dòng)脈組織中的定位表達(dá)，并應(yīng)用RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)頸動(dòng)脈壁內(nèi)HO-1mRNA及HO-1蛋白表達(dá)量。 3.體外培養(yǎng)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，用IGF-I誘導(dǎo)其增殖，用氯化血紅素和鋅原卟啉-9，分別以誘導(dǎo)和阻斷HO-1的表達(dá)，從而促進(jìn)和抑制CO

10、生成，通過(guò)RT-PCR及Westernblot檢測(cè)HO-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中碳氧血紅蛋白(COHb)含量，應(yīng)用四唑氮(MTT)比色法和同位素3H-TdR摻入試驗(yàn)檢測(cè)VSMCs增殖，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期。 研究結(jié)論:1.HO-1/CO系統(tǒng)通過(guò)減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，抑制VSMCs遷移和增殖從而抑制AS形成，延緩AS進(jìn)展；2.HO-1/CO系統(tǒng)通過(guò)抗氧化損傷，抑制VSMCs遷移和增