miR-27a雙靶向調(diào)控PPARγ與GREM1阻止激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs成脂分化并促進(jìn)其成骨分化的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是指股骨頭內(nèi)由于缺血改變造成股骨頭內(nèi)骨髓和骨細(xì)胞的變化，引起股骨頭結(jié)構(gòu)、功能的改變，導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)受限的疾病，股骨頭壞死同時具有極高的致殘率。根據(jù)不同病因，可將股骨頭壞死分為非創(chuàng)傷性和創(chuàng)傷性股骨頭壞死，創(chuàng)傷性 ONFH的病因包括明確的外傷史，是由外部條件造成的，而非創(chuàng)傷性 ONFH又分為激素性股骨頭壞死、酒精性股骨頭壞死以及非特異

2、性股骨頭壞死。其中，由于臨床工作中治療其他疾病廣泛應(yīng)用激素，造成激素性 ONFH發(fā)生的發(fā)病率占第一位，大部分患者往往合并有其他疾病，并且累及雙側(cè)股骨頭發(fā)病，造成髖關(guān)節(jié)的嚴(yán)重受損，對患者的日常生活造成很大的影響。目前，關(guān)于激素性股骨頭壞死發(fā)病的病理機(jī)制并不完全清楚，觀點各不相同，國內(nèi)外尚無有效的預(yù)防激素性股骨頭壞死的方法。
　　miRNA對于干細(xì)胞分化影響的研究開始逐漸明朗，然而，miRNA與股骨頭壞死關(guān)系的研究才剛剛開始，國內(nèi)外的

3、相關(guān)研究中關(guān)于運用miRNA雙靶向基因調(diào)控的作用來預(yù)防和治療激素性股骨頭壞死的報道尚未見到。因此，本研究利用激素誘導(dǎo)大鼠模型，使用 miRNA芯片檢測的方法全面分析激素誘導(dǎo)對于miRNA表達(dá)的影響，從中選取了與股骨頭壞死較為密切的miRNA-27a進(jìn)行研究。同時，又根據(jù)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)成脂基因PPARγ和成骨基因BMP-2拮抗劑GREM1均為miRNA-27a的靶基因。本研究希望通過調(diào)控miRNA-27a的表達(dá)靶向調(diào)控PPARγ和G

4、REM1的表達(dá)，在有效的降低由于激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的成脂分化作用的同時，促進(jìn)其主動的成骨分化作用，對股骨頭壞死初始環(huán)節(jié)的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行調(diào)控干預(yù)。所以，運用miRNA雙靶向基因調(diào)控的作用，達(dá)到預(yù)防和治療激素性股骨頭壞死的科學(xué)研究更加具有創(chuàng)新意義。
　　研究目的：
　　通過上調(diào)miRNA-27a的表達(dá)，靶向下調(diào)PPARγ和GREM1的表達(dá)，觀察其對于激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs產(chǎn)生的成脂分化和成骨分化作用的影響。
　　本實驗研究由下三個

5、部分組成：
　　第一部分：激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死中特異表達(dá)的miRNA分析
　　方法：
　?。?）動物模型的建立：取SPF級雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為模型組與對照組。模型組連續(xù)肌肉注射地塞米松磷酸鈉（10mg/kg）。4周時取股骨頭行常規(guī)石蠟包埋切片HE染色。
　　（2）ONFH特異表達(dá)miRNA篩選：兩組大鼠隨機(jī)各取3個樣本進(jìn)行miRNA基因芯片分析。
　?。?）miRNA基因芯片結(jié)果驗證和相關(guān)基因表達(dá)

6、檢測：使用qRT-PCR檢測激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型中 miRNA-27a和 miRNA-182的表達(dá)水平，以及PPARγ、GREM1的mRNA表達(dá)水平，并對miRNA-27a與PPARγ和GREM1的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性進(jìn)行分析。
　?。?）采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　?。?）4周時 HE染色，結(jié)果顯示：激素誘導(dǎo)模型組股骨頭內(nèi)骨小梁變細(xì)，稀疏、斷裂、排列紊亂，骨小梁面積明顯

7、減少；正常對照組股骨頭內(nèi)骨小梁結(jié)構(gòu)完整，無斷裂。
　　（2）miRNA基因芯片檢測結(jié)果顯示：激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型組與對照組相比較，miRNA表達(dá)明顯上調(diào)達(dá)3倍以上的有9個，表達(dá)明顯下調(diào)達(dá)3倍以下的有28個。
　　（3）qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：miRNA-27a的表達(dá)在模型組中明顯下調(diào)， miRNA-182則明顯上調(diào)（P＜0.05）。
　?。?）與對照組比較，模型組的PPARγ和GREM1的mRNA表達(dá)水平均明

8、顯上調(diào)（P＜0.05）。
　?。?）相關(guān)性分析結(jié)果顯示：PPARγ和 GREM1的表達(dá)水平與 miRNA-27a均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（R2=0.717、R2=0.662）。
　　第二部分：上調(diào)miRNA-27a對激素誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響
　　方法：
　?。?）大鼠 BMSCs制備：分離培養(yǎng)大鼠 BMSCs，流式細(xì)胞儀行表面抗原CD29，CD34、CD45、CD90鑒定。
　?。?）激素誘導(dǎo)BMSCs分

9、化實驗：對激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs進(jìn)行油紅―O‖染色，檢測甘油三酯的含量，檢測骨鈣素含量及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性。分別用qRT-PCR和Western blot檢測激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs中與成脂、成骨相關(guān)蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表達(dá)水平。
　　（3）miRNA-27a影響激素誘導(dǎo)BMSCs分化實驗：轉(zhuǎn)染miRNA-27a agomir上調(diào)激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs中miRNA-27a的表

10、達(dá)水平，qRT-PCR檢測大鼠BMSCs中miRNA-27a的表達(dá)水平；分別用qRT-PCR和Western blot檢測大鼠BMSCs中與成脂、成骨相關(guān)蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表達(dá)水平。對上調(diào)miRNA-27a的BMSCs進(jìn)行油紅―O‖染色以及堿性磷酸酶染色，檢測甘油三酯的含量、骨鈣素含量及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性。
　?。?）采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析

11、。
　　結(jié)果：
　?。?）流式細(xì)胞儀術(shù)結(jié)果顯示：第3代大鼠BMSCs的CD29、CD90的陽性率為99.84％、99.41%；CD34、CD45的陽性率為1.29%、1.42%。
　?。?）激素誘導(dǎo)BMSCs分化實驗結(jié)果顯示：激素誘導(dǎo)大鼠BMSCs14天，模型組BMSCs的油紅 O染色出現(xiàn)大量脂滴。模型組中的甘油三酯含量在7天和14天時均明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組中的
　　堿性

12、磷酸酶及細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量在7天和14天時均明顯低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)激素誘導(dǎo)的模型組大鼠 BMSCs在7天和14天時PPARγ、GREM1、C/EBPα的表達(dá)顯著高于正常對照組，且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Runx2、BMP-2的表達(dá)和miRNA-27a的表達(dá)均明顯低于正常對照組，且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　（3）miRNA-27a影響激素誘導(dǎo)BMSCs分化實

13、驗結(jié)果顯示：在模型組和無關(guān)對照組中PPARγ、GREM1和C/EBPα的表達(dá)均顯著高于miRNA-27a組和正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在模型組和無關(guān)對照組中Runx2、BMP-2的表達(dá)則顯著高于其他兩組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組和無關(guān)對照組的大鼠BMSCs油紅O染色中可見大量脂滴，而miRNA-27a組和正常對照組中量均極少。miRNA-27a組和正常對照組的大鼠BMSCs堿性磷酸酶（ALP）染色中均

14、可見大量細(xì)胞胞漿染色為藍(lán)/紫色，而模型組和無關(guān)對照組中量均極少。miRNA-27a組和正常對照組的大鼠BMSCs的甘油三酯含量均明顯低于模型組和無關(guān)對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。miRNA-27a組和正常對照組的大鼠BMSCs的堿性磷酸酶活性（ALP）及骨鈣素含量均明顯高于模型組和無關(guān)對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第三部分：miRNA-27a調(diào)控激素誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化機(jī)制的初步研究

15、>　　方法：
　?。?）生物信息學(xué)分析預(yù)測靶基因：用TargetScan和miRBase軟件分析預(yù)測miR-27a的靶基因。
　?。?）miRNA-27a靶基因鑒定：構(gòu)建pmirGLO-PPARγ和pmirGLO-GREM1重組報告基因載體，與轉(zhuǎn)染miRNA-27a agomir與miRNA-27a scramble共轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs中，通過雙熒光素酶報告證實miRNA-27a的作用靶標(biāo)。
　?。?）上調(diào)miRNA

16、-27a與沉默靶基因?qū)に卣T導(dǎo)BMSCs分化作用比較：實驗分為5組，為空白組（大鼠BMSCs）；模型組（大鼠BMSCs+地塞米松）；miRNA-27a組（miRNA-27a轉(zhuǎn)染BMSCs+地塞米松）；si-PPARγ組（si-PPARγ轉(zhuǎn)染BMSCs+地塞米松）；si-GREM1組（si-GREM1轉(zhuǎn)染BMSCs+地塞米松）。分組轉(zhuǎn)染24小時后， qRT-PCR檢測miRNA-27a的表達(dá)水平。BMSCs培養(yǎng)14天，分別用qRT-PCR

17、和Western blot檢測各組大鼠BMSCs中與成脂、成骨相關(guān)蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表達(dá)水平。BMSCs培養(yǎng)14天，對各組 BMSCs進(jìn)行油紅―O‖染色和堿性磷酸酶染色；進(jìn)行甘油三酯測定檢測；ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量以及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性。
　?。?）采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　?。?） TargetScan和

18、 miRBase生物信息學(xué)分析預(yù)測結(jié)果顯示：PPARγ和GREM1是miRNA-27a的作用靶點。
　?。?）雙熒光素酶報告實驗的結(jié)果顯示：miR-27a通過作用于 PPARγ和GREM1的3' UTR區(qū)，可以到達(dá)負(fù)向調(diào)控其表達(dá)的作用。
　　（3）大鼠 BMSCs轉(zhuǎn)染 miRNA-27a的鑒定結(jié)果示：miRNA-27a組中miRNA-27a表達(dá)水平顯著增高，并明顯高于其他4組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　

19、（4）BMSCs培養(yǎng)14天，模型組和si-GREM1組中PPARγ的表達(dá)均顯著高于正常組、si-PPARγ組和miRNA-27a組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和 si-PPARγ組中 GREM1的表達(dá)顯著高于正常組、si-GREM1組和miRNA-27a組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；空白組、si-GREM1組和miRNA-27a組中Runx2的表達(dá)則明顯高于si-PPARγ組和模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0

20、.05）；模型組和si-PPARγ組中BMP-2的表達(dá)明顯低于正常組、si-GREM1組和 miRNA-27a組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和si-GREM1組中C/EBPα的表達(dá)顯著高于正常組、si-PPARγ組和miRNA-27a組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　（5）BMSCs培養(yǎng)14天，油紅―O‖染色顯示：模型組和si-GREM1組的大鼠BMSCs中可見大量脂滴。而正常對照組、si-PPARγ組

21、和miRNA-27a組中量均極少。堿性磷酸酶染色顯示：正常對照組、si-GREM1組和 miRNA-27a組的大鼠BMSCs可見大量細(xì)胞胞漿染色為藍(lán)/紫色，而模型組和si-PPARγ組中量均極少。
　?。?）BMSCs培養(yǎng)14天，正常組、si-PPARγ組和miRNA-27a組的大鼠BMSCs的甘油三酯含量均明顯低于模型組和si-GREM1組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　?。?）BMSCs培養(yǎng)14天，正常組、si

22、-GREM1組和 miRNA-27a組的大鼠BMSCs的堿性磷酸酶活性（ALP）及細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量均明顯高于模型組和si-PPARγ組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型中，miRNA-27a的表達(dá)是顯著下調(diào)的， PPARγ和GREM1的表達(dá)明顯上調(diào)，并且miRNA-27a的表達(dá)與PPARγ和GREM1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。
　?。?）上調(diào)miRNA-27a的表達(dá)可