芽孢桿菌Bs2004菌株的鑒定、抑菌作用及發(fā)酵配方優(yōu)化研究.pdf

1、芽孢桿菌Bs2004菌株是從土壤分離獲得的一株生防芽孢桿菌，田間應用已證實該菌株能顯著提高馬鈴薯、萵苣的產(chǎn)量，能有效防治油菜菌核病、十字花科蔬菜根腫病等經(jīng)濟作物的病害。為更好的開發(fā)利用該菌株，本研究對該菌株進行種類鑒定、液體培養(yǎng)條件、抑菌作用及液體發(fā)酵配方研究，現(xiàn)將研究結果報道如下： 對芽孢桿菌Bs2004菌株的鑒定結果表明，其形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀以及生理生化特征均與伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中描述的枯

2、草芽孢桿菌的特征相符合，因此初步確定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。 通過對Bs2004菌株培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)液初始pH值、培養(yǎng)溫度、供氧條件、接種條件等的研究，Bs2004菌株搖瓶振蕩的最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基為’YSP，接種菌齡為12h，接種量為3％，初始pH值為7.5，培養(yǎng)溫度為32℃，裝液量為50mJ/250mL，搖瓶轉(zhuǎn)速為120r/min，培養(yǎng)時間為24h。 通過對Bs2004菌株

3、的抑菌機制研究表明，Bs2004菌株的菌體和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對供試的油菜菌核病菌、立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、三葉草白絹病菌均有一定的抑菌作用。采用對峙培養(yǎng)法測定Bs2004菌株的菌體對上述5種病原菌菌絲的抑制作用，顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，5種病原菌的菌絲都出現(xiàn)不同形態(tài)的畸形、原生質(zhì)凝結等現(xiàn)象。采用培養(yǎng)基含毒介質(zhì)法測定不同濃度的無菌濾液的抑菌活性表明：不同濃度的Bs2004菌株無菌濾液對5種供試病原菌菌絲生長均有一定的抑制作用，且濃

4、度愈高，抑菌作用愈強，但不同病原菌之間存在顯著差異，對油菜菌核病菌菌絲生長的抑制作用最強，EC<,50>為7.95％，對三葉草白絹病菌菌絲生長的抑制作用最弱，EC<,50>為31.00％。Bs2004菌株無菌濾液的穩(wěn)定性測試結果表明，Bs2004菌株無菌濾液的抑菌活性易受酸堿處理的影響，但高溫滅菌后仍然有較強的抑菌活性。 本研究通過搖瓶培養(yǎng)從8種應用于芽孢桿菌發(fā)酵的供試發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，篩選出適宜于芽孢桿菌Bs2004菌株生長的

5、初始發(fā)酵培養(yǎng)基配方(蔗糖10g，玉米粉20g，黃豆粉15g，硫酸錳0.1g，硫酸鎂0.1g，碳酸鈣2g，酵母浸粉3g，硫酸亞鐵0.02g，磷酸氫二鉀2g，蒸餾水1000mL)。用SAS統(tǒng)計軟件中Plackett-Burman設計對該初始發(fā)酵基礎培養(yǎng)基作進一步的優(yōu)化，從9個考察因素中篩選出硫酸鎂、硫酸亞鐵、黃豆粉和碳酸鈣為四個重要顯著因素，通過響應面分析法得到擬合效果較好的響應面方程：Y=(157.429-1.625x<,5>-1.875

6、x<,5>+3.4583x<,3>-1.875x6-5.5967x<,5><'2>-0.8125x<,8>x<,5>-5.9717x<,8>><'2>-2.5625x<,3>x<,5>-0.5625x<,3>x<,5>-5.2217x<,3><'2>-1.0625x<,6>x<,5>+0.9375x<,6>x<,3>-2.0625 X<,6>X<,3>-8.7217x<,6><'2>)×10<'7>，推測出當培養(yǎng)基中硫酸鎂為0.056g

7、/L，硫酸亞鐵為0.057g/L，碳酸鈣為1.631g/L，黃豆粉為19.847g/L時，Bs2004菌株發(fā)酵液含菌量最大值為1.59x10<'9>cfu/mL，經(jīng)搖瓶發(fā)酵實驗驗證此點的實測值為1.55x10<'9>cfu/mL，結果證實該回歸方程有效，并且存在極大值點。在搖瓶條件下，優(yōu)化后的發(fā)酵配方使芽孢桿菌Bs2004菌株發(fā)酵液的含菌量從8.92x10<'8>cfu/mL增JJ~16.61x10<'8>cfu/mL，提高了43.14