小鼠肝炎病毒N基因的表達(dá)與間接ELISA檢測方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬(Coronavirus)，是一個單股正鏈RNA病毒，帶毒小鼠廣泛存在于世界各國的實(shí)驗(yàn)小鼠群中。不同類型、不同毒株病毒在不同品系、年齡和免疫狀態(tài)的小鼠中可引起肝炎、腦脊髓炎和腸炎等許多不同的癥狀。通常情況下，大多數(shù)帶毒小鼠呈隱性感染，但與某些微生物發(fā)生混合感染時，或在實(shí)驗(yàn)條件的刺激下常會爆發(fā)疾病，是嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物最難清除的病毒之一。鼠群感染小鼠肝炎

2、病毒會改變各種免疫應(yīng)答參數(shù)，干擾試驗(yàn)結(jié)果，因此建立快速診斷方法十分必要。 目前，檢測小鼠肝炎病毒的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠肝炎病毒抗體。其包被抗原為純化的病毒，由細(xì)胞增殖方法獲得，此方法很難獲得高滴度的病毒，而且病毒分離復(fù)雜繁瑣。相比之下，用融合蛋白做抗原建立血清學(xué)檢測方法，具有更好的特異性和敏感性，同時操作比較方便，不會因雜蛋白而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。 本研究根據(jù)已發(fā)表的MHV N基因序列設(shè)計(jì)特異性引物

3、，以逆轉(zhuǎn)錄的小鼠肝炎病毒cDNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增出N基因主要抗原片段NP(S)，將其克隆到pGEM-T-easy載體中，鑒定正確的N(S)基因片段亞克隆入pGEX-6p-1原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白NP(S)，NP(S)經(jīng)純化后用SDS-PAGE和Western-blot對其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白NP(S)分子量為56x103，與預(yù)期大小相符，能與MHV陽性血清發(fā)生特異