鴨圓環(huán)病毒衣殼蛋白的原核表達及其間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、根據(jù)本實驗室提交的鴨圓環(huán)病毒(DuCV) GH01株基因序列信息，設(shè)計針對DuCVCapsid（Cap）基因的特異性引物，以實驗室保存病料為模板，對DuCV GH01株Cap基因進行PCR擴增，并且開展了:DuCV GH01株Cap基因特征分析、截斷Cap基因進行原核表達，并對重組表達蛋白進行親和層析純化，以Cap蛋白作為包被抗原，建立了檢測DuCV抗血清的間接ELISA方法，結(jié)果如下:
　　1.DuCV Cap基因的克隆及分子特

2、征分析利用PCR方法對DuCV GH01株Cap基因全長進行擴增，構(gòu)建Cap基因的T克隆重組質(zhì)粒并進行酶切鑒定，測序正確后對Cap基因及其編碼Cap蛋白進行特征分析。結(jié)果表明:通過PCR擴增獲得DuCV完整Cap基因，并成功構(gòu)建T克隆質(zhì)粒（pMD18-cap），測序分析表明，Cap基因全長大小為774bp，編碼蛋白為257aa，分子量為29.7kDa，等電點(PI)為10.79;編碼的Cap蛋白有一個保守結(jié)構(gòu)域，屬于Circovirus

3、_capsid家族;含有3個糖基化位點，21個磷酸化位點，5個可能的抗原表位，分別位于1～39、60～85、96～116、129～180、211～243等區(qū)域;無信號肽、跨膜區(qū);二級結(jié)構(gòu)預測其無規(guī)則卷曲較多，三級結(jié)構(gòu)預測顯示其同源建模只有一個合適模型，為豬圓環(huán)病毒Cap蛋白。系統(tǒng)進化樹分析表明，鴨圓環(huán)病毒GH01株與番鴨FJFQ315株親緣關(guān)系最近，與鵝圓環(huán)病毒及天鵝圓環(huán)病毒親緣關(guān)系較近，與雞傳染性貧血病毒關(guān)系較遠。Cap基因密碼子使用

4、分析顯示，存在密碼子偏嗜性，其中GGG、CAA、AAG、TTA與TCA使用頻率為零;亞細胞定位預測結(jié)果顯示，DuCV Cap蛋白主要定位于細胞核區(qū)域。
　　2.DuCV截斷Cap基因的克隆、原核表達及蛋白純化根據(jù)實驗室提交的DuCV GH01株完整Cap基因序列設(shè)計了針對截去核定位信號的截斷Cap基因引物序列，以實驗室保存病料為模板，對截斷Cap基因進行PCR擴增，并將擴增的截斷Cap基因克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)雙酶切和測序

5、鑒定正確后，克隆到表達載體pET-32a(+)，將獲得的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌Rosetta，通過對誘導溫度、IPTG濃度和誘導時間的優(yōu)化，確定最佳表達條件并進行大量誘導表達，表達重組Cap蛋白經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，收集洗脫液，測定純化蛋白濃度，利用SDS-PAGE分析純化效果。結(jié)果表明:擴增出預期大小為567bp的DuCV GH01株截斷Cap基因片段，且能成功連接到原核表達載體 pET-32a(+)，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-

6、32a-cap;經(jīng)過誘導條件的優(yōu)化，最終確定了蛋白表達的最優(yōu)條件為:在30℃、IPTG誘導濃度為0.8mmol/L條件下誘導16h，蛋白表達量達到最高值;重組Cap蛋白以包涵體的表達形式存在，大小約為39kDa。純化后的重組蛋白條帶較清晰，濃度約為1.5mg/mL，DuCV Cap蛋白的成功表達為后續(xù)試驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　3.以Cap重組蛋白作為包被抗原檢測DuCV抗血清的間接ELISA方法的建立與應用通過對最佳抗原包被濃度

7、、血清最佳稀釋倍數(shù)、最佳包被條件、封閉時間及最佳酶標抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化，確定間接ELISA方法最佳工作條件，確定陰陽臨界值，并對間接ELISA方法的特異性、敏感性和重復性進行檢測，最后通過臨床樣本的檢測，比較本研究建立的間接ELISA方法和傳統(tǒng)PCR檢測方法的符合率。結(jié)果顯示，本試驗建立的間接ELISA方法的最佳工作條件為:抗原最佳包被濃度為4μg/孔，血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶40，包被條件為37℃包被1h后放入4℃冰箱包被過夜，封閉時間