人自身抗原Ro52的酵母重組表達(dá)及其抗體檢測(cè)斑點(diǎn)免疫金滲濾法的建立.pdf

1、【目的】
　　 構(gòu)建酵母真核重組表達(dá)載體pPIC9K-Ro52，通過(guò)電穿孔導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌SMD1168菌株，在重組酵母SMD1168菌株中誘導(dǎo)Ro52蛋白的表達(dá)，獲取目的蛋白；并應(yīng)用初步純化的重組蛋白產(chǎn)物，建立DIGFA法檢測(cè)抗Ro52抗體，輔助診斷相關(guān)自身免疫性疾病。
　　 【方法】
　　 1.以人白血病MPN細(xì)胞的cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增人Ro52全長(zhǎng)基因序列。將PCR產(chǎn)物回收進(jìn)行TA克隆并鑒定

2、；將測(cè)序正確的TA克隆和pPIC9K抽提質(zhì)粒雙酶切后連接，重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后采用電穿孔法導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母SMD1168株中，構(gòu)建重組Ro52酵母真核表達(dá)載體。
　　 2.利用G418篩選高表達(dá)的重組菌，并對(duì)高表達(dá)重組菌進(jìn)行PCR鑒定；誘導(dǎo)Ro52酵母菌分泌表達(dá)獲得目的蛋白，經(jīng)硫酸銨濃縮沉淀，通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物。
　　 3.將純化濃縮后的重組蛋白R(shí)o52包被于硝酸纖維素薄膜上，建立斑點(diǎn)免疫金滲濾法（

3、DIGFA）檢測(cè)血清中Ro52抗體反應(yīng)；并與斑點(diǎn)酶免疫法進(jìn)行比對(duì)和臨床評(píng)價(jià)。
　　 【結(jié)果】
　　 1.以人白血病MPN細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增人Ro52基因，回收產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆后，送公司測(cè)序，TA陽(yáng)性克隆測(cè)序圖譜與報(bào)道一致。
　　 2.成功構(gòu)建出Ro52抗原酵母真核表達(dá)載體，提取pPIC9K-Ro52重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明插入片段閱讀框和方向正確。
　　 3.通過(guò)電

4、轉(zhuǎn)化基因?qū)雰x將目的片段導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168菌株中，獲取了Ro52酵母菌，重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，得到相對(duì)分子量約為50kD的Ro52表達(dá)產(chǎn)物。
　　 4.DIGFA法和斑點(diǎn)酶免疫法相比，經(jīng)ⅹ2檢驗(yàn)得ⅹ2=0.44，p>0.05，檢測(cè)結(jié)果表明兩種方法的陽(yáng)性符合率為95.2％，陰性符合率為94％，總體符合率為95％。
　　 【結(jié)論】
　　 本研究成功構(gòu)建了Ro52酵母真核重