小反芻獸疫病毒抗體、抗原免疫學檢測方法和納米金核酸檢測方法的建立.pdf

1、小反芻獸疫是能感染家養(yǎng)及野生小反芻動物的一種傳染性疾病。目前,小反芻獸疫呈現蔓延的趨勢。2007年我國西藏地區(qū)發(fā)生小反芻獸疫疫情,這是我國首次有該疾病發(fā)生的報道,因此建立靈敏、特異、快速的檢測方法對于早期發(fā)現小反芻獸疫非常重要。本研究旨在建立能快速且特異檢測小反芻獸疫抗體、抗原和核酸的分子生物學和免疫學方法。
　　 利用從奧地利引進的PPRV N基因全長質粒,根據N蛋白序列的保守性分別設計5對引物進行N蛋白的分段擴增,然后將PC

2、R擴增片段克隆至原核表達載體pET-32a(+)中,構建了PPRVN亞單位蛋白的原核重組表達質粒。將亞單位蛋白進行純化,并通過Western blot和ELISA進行鑒定。Western blot分析表明除第3亞單位蛋白以外,其余亞單位蛋白均具有反應原性。ELISA鑒定結果表明,PPRV N蛋白的B細胞表位主要位于第5亞克隆區(qū)域,即N蛋白的第Ⅳ區(qū)域。
　　 選擇具有反應原性且具有PPRV特異性的亞單位蛋白pET-PPRV-N5作

3、為包被抗原,建立間接ELISA方法用于檢測血清中PPRV抗體。對所建立的間接ELISA方法的相關條件進行了優(yōu)化,優(yōu)化后的間接ELISA檢測方法具有較高的特異性和靈敏性,與標準競爭ELISA的符合率高達98.4％。
　　 從PPRV山羊高免血清純化得到山羊抗PPRV的多克隆抗體(PAbs),采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液,并將PAbs標記至膠體金顆粒上制備金標墊。將純化后的重組pET-PPRV-N蛋白及anti-goat IgG

4、分別包被至硝酸纖維素膜的檢測線(T線)及質控線(C線),將金標墊、NC膜等組裝成膠體金試紙條。所制備的膠體金試紙條可以特異性的檢測PPRV抗原,檢測極限達到10 ng,該方法具有良好的特異性,操作簡便,可廣泛應用丁基層檢測。
　　 針對PPRV N基因設計一對探針,分別在5’端和3’端修飾上巰基和生物素。將巰基化的探針標記至檸檬酸鈉還原法制備的納米金顆粒上,制備納米金核酸探針,將納米金核酸探針與靶序列及生物素標記的探針進行雜交,