人Smith D1抗原的重組表達(dá)及其抗體檢測方法的建立.pdf

1、SLE是一種自身免疫性疾病，患者血清中可檢出多種自身抗體，其中最重要的是抗ds-DNA抗體和抗Sm抗體，雖然抗ds-DNA抗體對于確診SLE及判斷狼瘡的活動(dòng)性參考價(jià)值較大，但SLE病人經(jīng)治療(如使用激素)，抗ds-DNA抗體的陽性率明顯降低，而抗Sm抗體雖然與SLE病情活動(dòng)與否無關(guān)，但治療后抗Sm抗體仍持續(xù)陽性，故抗Sm抗體又稱為回顧性抗體，被認(rèn)為是SLE的標(biāo)志性抗體，并已成為美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(American College ofRhe

2、umatology，ARA)1997年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。 在Sm抗原中能與抗Sm抗體發(fā)生反應(yīng)的是Sm B/B'和Sm D，而Sm E、F、G及N幾乎不與抗Sm抗體起反應(yīng)?？筍m B/B'抗體與其它抗RNP抗體存在交叉反應(yīng)，降低了抗Sm B/B'抗體對SLE診斷的特異性，故抗Sm D抗體被認(rèn)為是SLE的標(biāo)志性抗體，而Sm D抗原中最重要的免疫活性蛋白是Sm D1，因此抗Sm D1抗體的檢測對SLE的診斷具有重要的作用。

3、本研究利用分子克隆技術(shù)，以人白血病HL-60細(xì)胞的cDNA文庫為模板，PCR擴(kuò)增人Sm D1基因編碼序列，并將其插入原核表達(dá)載體pGEX-5T，構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pGEX-5T-Sm D1，在Ecoli BL21(DE3 plysS<'+>)中誘導(dǎo)Sm D1的表達(dá)。通過12％SDS-PAGE電泳、蛋白兔疫印跡等鑒定表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，重組Sm D1在Ecoli BL21(DE3 plysS<'+>)中獲得較高表達(dá)，并具有較高的抗原活性

4、。所得的包涵體經(jīng)變性、復(fù)性后用GST層析柱進(jìn)行初步分離純化，得到了純度較高的重組蛋白，為特異性抗Sm D1抗體的檢測奠定了基礎(chǔ)。 由于原核表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，在純化方面較為復(fù)雜，故本研究嘗試在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。同樣以人白血病HL-60細(xì)胞的cDNA文庫為模板，PCR擴(kuò)增人Sm D1基因編碼序列，并將其插入真核表達(dá)載體pPIC9K，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pPIC9K-Sm D1，在畢赤酵母SMD1168中誘導(dǎo)Sm D1的分泌型表

5、達(dá)。經(jīng)硫酸氨濃縮沉淀，通過Tricine-SDS-PAGE電泳、蛋白兔疫印跡等鑒定表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，重組Sm D1在畢赤酵母SMD1168中同樣獲得較高表達(dá)。 本文應(yīng)用初步純化的真核產(chǎn)物建立DIGFA法檢測抗Sm D1抗體，敏感性與IB法相同，特異性稍差，但本法具有簡便、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，由于檢測標(biāo)本有限，該法在臨床上的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步研究。 總之，本實(shí)驗(yàn)室通過分子克隆技術(shù)初步獲得了人Sm D1抗原，并對其抗原性進(jìn)行