重組人精子特異性乳酸脫氫酶抗原的制備及其在不育癥自身抗體檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：(1)原核表達(dá)制備重組人精子特異性乳酸脫氫酶(rhLDH—C4)抗原。(2)以rhLDH—C4為包被抗原，建立人血清抗LDH—C4抗體(IgG型)檢測的間接ELISA方法，為人血清抗精子抗體(ASA)的檢測及免疫不育癥的診斷提供新的實驗方法。(3)探討人血清抗LDH-CA抗體IgG與不育癥的關(guān)系。 方法：(1)應(yīng)用本室構(gòu)建的pET一28a(+)一hLDH—C重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecol．BL21(DE3)plysS；經(jīng)菌

2、液PCR及酶切電泳鑒定后，用IPTG誘導(dǎo)rhLDH—C4蛋白的可溶性表達(dá)，經(jīng)Ni+一NTA親和層析法一步純化，制備rhLDH-C4抗原；SDS—PAGE鑒定重組蛋白的純度；乳酸脫氫酶同工酶活性染色檢測重組蛋白的酶活性。(2)應(yīng)用Westernblotting從不育患者血清標(biāo)本中篩選出一例抗LDH—C4抗體陽性的血清標(biāo)本作為陽性對照，以25例處女血清標(biāo)本OD測定值確定ELISA的判定臨界值(cut—off)，建立間接ELISA方法，并優(yōu)化

3、其它檢測參數(shù)。(3)應(yīng)用該ELISA方法，分別檢測74例正常男女(生育組)和177例不明原因不育男女(不育組)血清標(biāo)本中的抗LDH—C4抗體(IgG型)的水平。 結(jié)果：(1)1000ml菌液經(jīng)誘導(dǎo)純化后，得rhLDH—c4蛋白約1．5mg：純化的rhLDH—c4在SDS-PAGE電泳中僅顯示一條區(qū)帶；乳酸脫氫酶同工酶活性染色顯示rhLDH-C4活性區(qū)帶位于LDH一4附近。(2)ELISA檢測參數(shù)的確定：rhLDH-C4抗原最適包

4、被濃度為1μ／ml，判定臨界值(cut-off)為O．120。(3)血清標(biāo)本ELISA檢測結(jié)果：不育組陽性率顯著高于正常生育組(30．51％對9．46％，PO．05)。 結(jié)論：(D成功地制備了高純度的rhLDH—C4抗原，該蛋白具有類似天然乳酸脫氫酶同工酶的酶活性。(2)首次建立了人血清抗LDH-C4抗體(IgG型)檢測的間