基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的水痘—帶狀皰疹病毒中和抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、水痘-帶狀皰疹病毒(VaricellaZosterVirus，VZV)是引起水痘和帶狀皰疹的病原體，具有嚴(yán)重的危害性。目前已有基于vOka株的水痘減毒活疫苗上市，在較好地預(yù)防水痘的同時(shí)，卻增加了接種者帶狀皰疹的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。由VZV引發(fā)的帶狀皰疹目前尚缺乏特效治療藥物。VZV中和抗體在阻斷病毒體內(nèi)擴(kuò)散及感染中起到重要的作用，同時(shí)也有望成為帶狀皰疹的特異治療藥物。然而，目前對(duì)于VZV中和抗體的檢測(cè)方法仍存在許多問題，難于同時(shí)滿足快速、準(zhǔn)確、高

2、通量的需求。為此，本研究探索建立一種新型的基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法的VZV中和抗體高通量檢測(cè)方法。
　　本研究首先探索獲得可高效檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)病毒抗原的檢測(cè)抗體。由于膜蛋白是暴露在VZV顆粒表面的包膜組成成分，存在親和表位和中和表位，因此本研究將探索獲得具有良好反應(yīng)特異性和檢測(cè)靈敏度的VZV糖蛋白單抗。通過對(duì)VZV保護(hù)液成分優(yōu)化和凍融時(shí)間的摸索制備獲得高滴度的無細(xì)胞VZV病毒。將無細(xì)胞病毒免疫小鼠后篩選獲得6株可特異性結(jié)合Glycopr

3、oteinK(gK)抗原的單克隆抗體。對(duì)這6株單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步的表位鑒定，確定其關(guān)鍵親和表位處于gK的281～295位氨基酸。選擇其中一株單抗18A10進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，確定了其最短結(jié)合表位和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分布。本研究進(jìn)一步制備了辣根過氧化物酶標(biāo)記的18A10(HRP-18A10)用于VZV感染細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)間、感染滴度等優(yōu)化，成功建立了較為穩(wěn)定的VZV中和抗體酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的空斑減少法平行比

4、較，新型酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法對(duì)鼠血清標(biāo)本的檢測(cè)特異性為100％，檢測(cè)結(jié)果一致性為95.65％，顯示了新方法具有良好的可靠性。VZV中和抗體酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法的檢測(cè)時(shí)間僅需2天，可在96孔板中利用自動(dòng)化的儀器設(shè)備進(jìn)行快速檢測(cè)，避免了傳統(tǒng)方法的主觀誤差，有利于進(jìn)行快速高通量檢測(cè)。
　　綜上所述，本研究通過篩選獲得了VZV-gK的特異性單克隆抗體，并應(yīng)用于建立VZV中和抗體酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法，相比于空斑減少法，存在省時(shí)、高通量檢測(cè)的明顯優(yōu)