膀胱尿道功能發(fā)育及尿失禁治療的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 下尿路障礙在成人和小兒均常見。全球超過2億人因為下尿路功能障礙就醫(yī)。其中下尿路功能障礙引起的尿失禁最常見。膀胱逼尿肌-外括約肌功能協(xié)同失調(diào)(Detrusor-SphincterDysfunction，DSD)是導(dǎo)致嬰幼兒尿失禁，遺尿的常見原因。壓力性尿失禁(StrssUrinaryIncontinence，SUI)和膀胱過度活動癥(OveractiveBladder，OAB)-急迫性尿失禁(UrgeUrina

2、ryIncontinece，UUI)是成人尿失禁常見的類型其病理生理變化分別是尿道橫紋肌括約肌缺損、盆底肌肉松弛和DSD。這些成人和小兒下尿路障礙疾病的病因絕大部分與下尿路肌肉病變有關(guān)，其中以下尿路橫紋肌肉功能紊亂為主。為了更好地說明下尿路橫紋肌對尿失禁為主的下尿路障礙的發(fā)病機制的作用，有必要知道下尿路橫紋肌在新生兒的正常發(fā)育和功能發(fā)展過程。目前對新生兒排尿控尿模式的研究報道不多，很多基于4小時自由排尿觀察。不完全排尿在新生兒排尿中比例

3、很高，早產(chǎn)兒明顯多于足月兒。代表生理性DSD間斷排尿在新生兒中也較常見，但更多見于早產(chǎn)兒，這說明新生兒的尿道橫紋括約肌控尿很不成熟。因此有必要對人體出生后早期階段-新生兒期的排尿方式發(fā)展過程進行研究，從而為新生兒期排尿發(fā)育補充數(shù)據(jù)，也能更好追述成年后尿失禁發(fā)生的原因。
　　 成人尿失禁主要有藥品和手術(shù)治療。OAB導(dǎo)致急迫性尿失禁患者目前主要是藥物治療，患者服用乙酰膽堿受體阻滯劑，如索利那新，托特羅定等。對于這類藥物的療效，有的報

4、道服藥后尿失禁癥狀有改善，有的報道患者無任何影響，有效與無效的比值，以及有效無效的標(biāo)準(zhǔn)，各個醫(yī)療中心報道不一致。并且這類藥物對膀胱逼尿肌尿動力參數(shù)影響如何，國內(nèi)少見報道。成人壓力性尿失禁目前多采用手術(shù)治療，如TVT/TVT-O手術(shù)。這個術(shù)后療效如何，仍然是報道不一。因此我們對臨床上OAB急迫性尿失禁患者服用索利那新12周的療效和已行TVT/TVT-O手術(shù)的壓力性尿失禁患者做了隨訪調(diào)查，發(fā)現(xiàn)M受體阻滯劑索利那新對大部分患者的OAB尿失禁狀

5、況有改善，但是仍然有部分患者無效。而壓力性尿失禁的TVT/TVT-O手術(shù)治療能緩解大部分患者的尿失禁，但仍然不能徹底解決尿失禁問題，并且很多患者自述有盆底慢性疼痛或者不適感，部分難治性尿失禁患者無任何治療效果。還有其他研究人員報道了采用下尿路注射填充劑或者藥物治療壓力性尿失禁，如尿道下牛膠原注射壓力性尿失禁，A型肉毒毒素(BotulinumToxin，BTX)治療急迫性尿失禁等。這些治療方法在短期的效果明顯，但是長期效果差，并且有嚴(yán)重的

6、并發(fā)癥。目前，國際上熱點的尿失禁的研究專注于再生修復(fù)受損尿橫紋肌干細胞療法或?qū)ふ壹毎麅?nèi)新的藥物分子靶點。
　　 組胺是生物體合成的活性氨，是由組胺酸脫羧而形成的，主要在肥大細胞，嗜堿性細胞，腸道嗜鉻細胞中合成，參與機體免疫，生化等功能。組胺到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有4種受體(H1R，H2R，H3R，H4R)。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對組胺受體（HistamineReceptor）H1R和H2R研究多年，這兩種受體是傳統(tǒng)的組胺受體，它們對組胺的親

7、和力PK1分別為4.2和4.3。在平滑肌細胞，心肌細胞和骨骼肌組織中均發(fā)現(xiàn)這2種受體的表達，并檢查出他們參與細胞的增殖和收縮。而本世紀(jì)初，研究者才開始關(guān)注到某些細胞漿中存在分子量為73kD的組胺前體存在。這種前體在某些細胞中的含量比傳統(tǒng)的組胺合成細胞低100到1000倍。據(jù)推測這些細胞中存在某種正電荷轉(zhuǎn)運蛋白(cationtransporterprotein，CTP)，可以幫助某些能少量合成組胺及其前體的細胞淹著濃度梯度轉(zhuǎn)運組胺或前體到

8、細胞外。這些組胺的濃度很低，不可能去激活傳統(tǒng)的組胺H1R，H2R受體。因此人們開始尋找組胺新的受體。近10年，一些研究細胞膜上G-蛋白偶聯(lián)的跨膜蛋白受體的研究者發(fā)現(xiàn)了組胺新的受體，組胺H3R，H4R受體。這兩種新型組胺受體對組胺親和指數(shù)PK1值分別為8.0和8.2，對組胺的結(jié)合力相當(dāng)于前2種傳統(tǒng)受體的10000倍。進一步的研究，許多能少量合成組胺的非傳統(tǒng)合成細胞被發(fā)現(xiàn)，比如樹突細胞，淋巴細胞等。他們均存在新型的組胺受體。同時在中樞和周圍

9、神經(jīng)細胞突出前膜發(fā)現(xiàn)了H3R廣泛存在。肌肉細胞中也發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)和新型的組胺受體，如在支氣管平滑肌細胞中發(fā)現(xiàn)了組胺H1R，H2R，H3R;在心肌細胞中發(fā)現(xiàn)了H1R，H2R，H3R;腸道平滑肌和膀胱逼尿肌細胞中H1R，H2R，H3R，H4R存在。國外許多研究者已大量研究了組胺傳統(tǒng)和新型受體在細胞中的信號傳導(dǎo)的報道。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，4種組胺受體均為G-蛋白偶聯(lián)跨膜蛋白受體（G-coupledtransmembranereceptor，GCTR），其

10、中H1R和H2R與Gas亞基偶聯(lián)，加強腺苷環(huán)化酶活性，增加細胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷(Cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)的合成，增加PKA信號的傳導(dǎo)和下游蛋白的磷酸化。H3R和H4R則與Gai亞基偶聯(lián)，抑制腺苷環(huán)化酶(Adenlatecyclase，AC)的功能，降低細胞內(nèi)第二信使cAMP的合成，抑制PKA信號的傳導(dǎo)和下游蛋白的磷酸化。目前大量發(fā)現(xiàn)組胺新舊受體在其他器官的肌肉細胞中表達，我們開始研究組胺受

11、體在成人尿道橫紋肌括約肌和肌肉干細胞分化成橫紋肌過程中的表達，進而探討其在下尿路橫紋肌中的功能和通路。
　　 本研究目的在于首先在臨床上調(diào)查出正常新生兒下尿道排尿控尿功能發(fā)育參數(shù)，然后檢測了臨床上藥物治療成人OAB-UUI及手術(shù)治療SUI的大體療效情況，再通過實驗室測量組胺受體在成人下尿路肌肉組織及其肌肉干細胞分化過程中的表達，最后探討H3R對收縮中肌肉細胞胞漿中鈣離子濃度及其可能的細胞內(nèi)信號通路，初步探討出組胺受體在下尿路功能

12、障礙疾病中的作用，從而為以后臨床治療下尿路障礙提供新的可能的細胞內(nèi)藥物靶位點或者組織工程學(xué)治療方法。
　　 第一部分，新生兒控尿機制發(fā)育—新生兒期排尿功能發(fā)展研究
　　 材料和方法：
　　 選取21例，無病理疾病的單胎正常新生兒。足月兒10例，早產(chǎn)兒11例;每位新生兒均被觀察其出生第1天，4天，7天，14天，28天12h連續(xù)自由排尿，記錄排尿時間、每次排尿量，B超測量排尿后殘余尿量，排尿時清醒睡眠狀態(tài)。
　

13、　 結(jié)果：
　　 共記錄排尿745次。足月兒和早產(chǎn)兒的排尿次數(shù)均在天齡第7天時明顯多余第4天(P＜0.05)。早產(chǎn)兒的排尿次數(shù)在第14天時開始下降，第28天次數(shù)明顯低于第14天(P＜0.05)。足月兒的排尿量在28天記錄數(shù)據(jù)中，明顯增加了兩次，早產(chǎn)兒在這28天中增加了一次。足月兒的殘余尿在28天內(nèi)有波動。
　　 足月兒在第14天和28天時，排尿次數(shù)明顯少于早產(chǎn)兒(P＜0.05);但排尿量在第4，7，14，28天時，明顯

14、多于早產(chǎn)兒(P＜0.05);殘余尿量在第4天，第28天時也明顯多于早產(chǎn)兒(P＜0.05)。不完全排空和間斷排尿在早產(chǎn)兒中較足月兒多見。
　　 第二部分，控尿機制失調(diào)—成人尿失禁的藥物、手術(shù)治療效果評估
　　 材料和方法：
　　 1.20例OAB患者服用膀胱逼尿肌M3受體阻滯劑索利那新治療。男12例，女8例。年齡21-83歲，平均43歲。病程1-20年，平均8年?；颊哌B續(xù)服用索利那新5mg/d12周。服藥前后行尿動

15、力學(xué)檢查，觀察膀胱逼尿肌功能變化、記錄OABSS得分、感知膀胱癥狀量表(PPBC)評分，統(tǒng)計學(xué)比較治療前后的差異。
　　 2.選取已行TVT-O手術(shù)治療0.5-3年的老年女性Ⅰ、Ⅱ型壓力性尿失禁患者80例，術(shù)前年齡在60歲以上，采用ⅡQ-7生活質(zhì)量和UDI-6癥狀量表進行電話問卷調(diào)查，比較患者術(shù)前術(shù)后日常生活與下尿路癥狀的差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.OAB患者治療前后平均逼尿肌無抑制收縮波個數(shù)分別為2.3±2

16、.4與0.6±1.3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其中6例患者服藥后逼尿肌無抑制收縮完全消失。治療前后膀胱初次排尿感容量(103±67ml與178±89ml)、膀胱容量(189±133ml與299±89ml)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);膀胱順應(yīng)性、最大尿流率時逼尿肌壓力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。服藥前后OABSS量表的尿急評分（5.0±0.0與2.8±2.0）、白天排尿評分(1.3±0.5與0.4±0.7)、夜尿評分

17、（2.9±0.4與1.4±0.92）、尿失禁評分（3.3±2.1與1.6±2.1）、PPBC評分(5.5±0.5與2.9±1.6)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。6例患者訴有口干現(xiàn)象。
　　 2.73例壓力性尿失禁患者隨訪成功，年齡(60～72)歲，平均(64±6.5)歲。術(shù)前患者做家務(wù)、活動、娛樂、外出、社交及情緒明顯受到尿失禁癥狀影響，評分為(9～25)分，平均(17±6.7)分;下尿路癥狀尿急、尿頻、運動、漏尿量、排尿

18、困難及尿痛評分為(8～21)分，平均(14±4.7)分。輕度尿頻8.2％(6/73).尿墊使用率為97.3％（71例）。11例患者訴排尿有恥骨上區(qū)不適。術(shù)后患者自評生活質(zhì)量明顯改善，日常生活評分(2～13)分，平均(6.4±3.2)分，下尿路癥狀評分(1～9)分，平均(5.4±3.2)分。輕度尿頻1.4％(1/73)。39例(53.4％)患者尿失禁癥狀完全消失，尿墊使用率46.6％（34例）。18患者訴術(shù)后排尿有輕度恥骨上區(qū)不適。

19、>　　 第三部分，組胺受體在尿道橫紋肌和成肌分化過程中的表達
　　 材料和方法：
　　 1.誘導(dǎo)橫紋肌肉干細胞C2C12的成肌分化，標(biāo)志物:早期標(biāo)志物desmin，中期標(biāo)志物myogenin，晚期標(biāo)志物肌球蛋白重鏈;實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測量分化標(biāo)志物和組胺4種受體(H1R，H2R，H3R，H4R)的mRNA表達。免疫熒光染色各標(biāo)志物和組胺H3受體（histamineH3receptor，H3R）
　　

20、 2.分化過程中，H3R拮抗劑Ciproxifan拮抗H3R受體6d，測量各標(biāo)志物表達情況。
　　 3.收集臨床上因成年男性中段尿道橫紋肌標(biāo)本，選取尿道外括約?。M紋?。┎糠肿鍪灠?，石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色組胺4種受體。
　　 結(jié)果：
　　 1.H1RmRNA在未分化的C2C12干細胞中表達較高，但隨著成肌分化，表達逐漸減低;H2RmRNA在肌源性干細胞及其分化中表達均較低，但比較穩(wěn)定。H3RmRNA在肌源

21、性干細胞中表達很低，但是隨著成肌分化表達呈指數(shù)增加。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)H3R蛋白染色隨著分化而熒光強度增加。H4R在肌源性干細胞及其成肌分化中均未檢測出表達。
　　 2.H3R阻滯劑Ciproxifan在分化過程中拮抗H3R，分化6天后，3種分化標(biāo)志物表達與對照組相比，無差異(P＞0.05)。
　　 3.成人下尿路橫紋肌的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)H1R，H2R，H3R染色陽性，其中H1R陽性程度最強，H3R中度陽性，H2R弱陽

22、性。
　　 第四部分，組胺H3R受體在橫紋肌細胞收縮時對胞漿中鈣離子的影響和可能的信號通路
　　 材料和方法：
　　 1.Fluo-4標(biāo)記的鈣離子結(jié)合劑，測量雙極交流電200mA刺激肌肉細胞時肌漿中鈣離子的變化;H3R選擇性激動劑a-甲基組胺(RMeHA)6種不同濃度(1nM，10nM，100nM，4uM，10uM，100uM)刺激在交流電下收縮的成熟肌肉細胞，測量收縮中鈣離子濃度峰值的變化情況。
　　

23、2.熒光標(biāo)記H3R拮抗劑HT-1240追蹤H3R在成熟橫紋肌細胞的表達定位及該物質(zhì)在細胞內(nèi)運輸過程
　　 3.細胞環(huán)磷酸腺苷(cAMP)提升劑弗斯可林(forskolin)增加細胞內(nèi)部cAMP表達;H3R激動劑RMeHA6種不同濃度(1nM，10nM，100nM，1uM，10uM，100uM)刺激成熟肌肉細胞，測量細胞表達cAMP的水平;
　　 4.用H3R阻滯劑Ciproxifan預(yù)處理細胞，測量6種不同濃度的RMeH

24、A刺激細胞后cAMP的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.RMeHA濃度為10nM，100nM，1uM，10uM時，刺激5min，10min，20min均能明顯降低胞漿中鈣離子峰值(P＜0.05)，而濃度為100nM的RMeHA在10min，20min對電刺激細胞中Ca2+的抑制百分率最高。整體看來，同一濃度的RMeHA對Ca2+的抑制效果，在20min內(nèi)，隨著時間的增加而稍有增加，即在20min時所見到的抑制效果比在5

25、min時有所增加低濃度H3R激動劑。RMeHA低濃度1nM，高濃度100uM，對收縮細胞胞漿中鈣離子峰值均無明顯影響(P＞0.05)。
　　 2.ST1240濃度越高，清洗細胞后，細胞內(nèi)殘存的熒光強度越高。
　　 3.靜息細胞的基礎(chǔ)cAMP濃度很低，弗斯可林10uM可以明顯提高細胞內(nèi)cAMP的合成。RMeHA1nM時，對細胞內(nèi)由FK提升的cAMP無影響。RMeHA濃度10nM，100nM，1uM時能降低由FK增加的cAM

26、P合成(P＜0.05)，并隨濃度增加，cAMP在細胞中濃度下降。RMeHA高濃度(10uM，100uM)時，RMeHA的抑制效果不明顯，甚至有提升細胞cAMP的作用。
　　 4.用CPF預(yù)處理細胞后，RMeHA在1nM時，對細胞內(nèi)由FK提升的cAMP仍然無影響。但RMeHA濃度在10nM，100nM，1uM時候也能降低由FK增加的cAMP合成(P＜0.05)，并隨RMeHA濃度增加，cAMP在細胞中濃度下降，與無處理組差別不大。

27、RMeHA高濃度(10uM，100uM)時，RMeHA不出現(xiàn)抑制效果，而是有提升細胞cAMP的作用，并且比不處理組提高cAMP效果更明顯(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.新生兒期尿道橫紋肌的發(fā)育主要表現(xiàn)在新生兒排尿模式的變化。間斷排尿和不完全排空現(xiàn)象預(yù)示著膀胱-尿道括約?。M紋?。﹨f(xié)同失調(diào)。在足月兒和早產(chǎn)兒中，可見間斷排尿，而早產(chǎn)兒更常見。這預(yù)示著他們下尿路肌肉發(fā)育的成熟度很低導(dǎo)致排尿功能很不成熟，早產(chǎn)兒更顯著

28、。但是第28天時的新生兒的間斷排尿明顯少于出生后1天和4天的新生兒?？傊?，新生兒膀胱-尿道括約?。M紋肌）協(xié)同失調(diào)的改善過程顯示了尿道橫紋肌在新生兒期逐漸發(fā)育的過程。
　　 2.成人的尿道橫紋肌功能紊亂導(dǎo)致的疾病主要是OAB引發(fā)的尿失禁和壓力性尿失禁。膀胱逼尿肌M3受體阻滯劑索利那新藥物治療膀胱過度活動癥在特發(fā)性O(shè)AB的病人有很大療效，但是對一部分病人，比如膀胱-尿道括約肌協(xié)同失調(diào)的OAB-UUI患者病人效果不明顯，甚至無效。T

29、VT/TVT-O手術(shù)對因盆底肌肉松弛導(dǎo)致的壓力性尿失禁有一定療效，但是部分病人復(fù)發(fā)率和不適感明顯。因此需要引入對尿失禁-下尿路障礙的新治療理念，如組織工程學(xué)治療或者新的藥物細胞分子靶位點。
　　 3.組胺受體在肌肉細胞的分化，成熟，功能，修復(fù)方面起到了十分重要的作用。在肌肉干細胞分化為橫紋肌細胞過程中和成年男性尿道橫紋肌中發(fā)現(xiàn)H1R，H2R和H3R。其中H1R受體可能參與細胞的增殖，H2R受體可能參與細胞膽堿能刺激后的松弛，H3

30、R在成肌分化過程中沒有發(fā)現(xiàn)參與分化功能，可能與成熟細胞的生理功能相關(guān)。
　　 4.H1R和H2R這兩個受體可能與G蛋白激動性亞基阿爾法相偶聯(lián)，增加腺苷環(huán)化酶的活性。然而最重要的H3R可能與G蛋白抑制性亞基Gi/o相偶聯(lián)，抑制腺苷環(huán)化酶，進而降低細胞內(nèi)cAMP表達，抑制PKA通路，阻止肌膜上鈣離子通道和肌漿網(wǎng)膜上鈣離子通道磷酸化，從而阻止了鈣離子從肌漿網(wǎng)中進入胞漿中，降低胞漿中的鈣離子濃度，最終減低肌肉細胞的收縮作用，維持細胞的損