瑪咖(Lepidium meyenii)中抗骨質(zhì)疏松活性物質(zhì)篩選及其機(jī)制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松是嚴(yán)重危害人類健康的骨代謝疾病，而且發(fā)病率隨著人口老齡化逐漸升高，目前治療骨質(zhì)疏松的藥物在有效性和安全性方面存在一定的問題，迫切需要研發(fā)安全而有效的防治手段，若能針對(duì)尚未發(fā)病和癥狀較輕的人群開發(fā)具有一定療效且安全無副作用的功能食品，將是一條很好防治骨質(zhì)疏松的途徑。
　　瑪咖（Lep id ium meye nnii Wa lp.）具有改善更年期綜合癥等多種生理功效，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗骨質(zhì)疏松效果，但其抗骨質(zhì)疏松的功

2、效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清楚，嚴(yán)重阻礙了瑪咖抗骨質(zhì)疏松功能產(chǎn)品的開發(fā)和利用。本文在前期研究基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建瑪咖次生代謝物數(shù)據(jù)庫，并以誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松發(fā)病的關(guān)鍵因子雌激素受體為靶點(diǎn)，采用虛擬篩選技術(shù)尋找瑪咖化合物庫中潛在的抗骨質(zhì)疏松活性成分，并通過反向?qū)蛹夹g(shù)預(yù)測活性成分可能的作用途徑，進(jìn)一步在細(xì)胞和動(dòng)物水平上進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，取得如下創(chuàng)新性結(jié)果：
　　（1）通過分子對(duì)接預(yù)測，發(fā)現(xiàn)瑪咖酰胺最有可能是瑪咖抗骨質(zhì)疏松活性物質(zhì)，其中，N-benz

3、yl-pa lmita mide是結(jié)合能力最好的結(jié)構(gòu)之一。通過文獻(xiàn)調(diào)查構(gòu)建了瑪咖次生代謝物數(shù)據(jù)庫，并利用AutoDock Vina將其中的化合物與雌激素受體(PDB號(hào)：1GWR)進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)合自由能分布在-7.7到-2.1 kcal/mo l之間，其中，瑪咖酰胺類化合物的結(jié)合能最低，在-7.7到-7.0 kcal/mo l之間，表明瑪咖酰胺是最有可能的抗骨質(zhì)疏松活性物質(zhì)；進(jìn)一步研究瑪咖酰胺結(jié)構(gòu)與雌激素受體結(jié)合能力之間的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)苯

4、基、酰胺鍵和碳鏈長度大于15的脂肪長鏈?zhǔn)蔷S持瑪咖酰胺類物質(zhì)結(jié)合雌激素受體能力的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其中，N-benzyl-palmita mide是結(jié)合能力最好的結(jié)構(gòu)之一。
　?。?）通過反向?qū)宇A(yù)測，發(fā)現(xiàn)N-benzyl-palmitamide可通過與細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、視黃酸受體、甲狀腺素運(yùn)載蛋白等視黃酸信號(hào)通路相關(guān)蛋白，以及維生素 D3受體和碳酸酐酶Ⅱ相互作用，調(diào)節(jié)骨代謝。通過采用 PharmMapper進(jìn)行反向預(yù)測，

5、發(fā)現(xiàn) N-benzyl-pa lmita mid e在人體內(nèi)的潛在作用靶點(diǎn)為細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白2、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、含黃素胺氧化酶B、視黃醇結(jié)合蛋白4、視黃酸受體β、維生素D3受體、α-生育酚轉(zhuǎn)移蛋白、血清蛋白和碳酸酐酶Ⅱ，表明N-benzyl-palmitamide可能對(duì)視覺系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和基礎(chǔ)代謝起到調(diào)節(jié)作用。其中，視黃醇結(jié)合蛋白、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白、視黃酸受體、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、維生素D3受體和碳酸酐

6、酶Ⅱ均與骨代謝密切相關(guān)，進(jìn)一步表明瑪咖酰胺可能具有抗骨質(zhì)疏松活性。
　　（3）通過細(xì)胞模型評(píng)價(jià)，證實(shí)N-benzyl-palmitamide具有促成骨作用。通過采用MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞模型評(píng)價(jià)N-benzyl-palmitamide對(duì)成骨細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)N-benzyl-palmitamide可以促進(jìn) MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)礦化，具有促成骨作用；進(jìn)一步探索其作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn) N-benzyl-pa

7、 lmita mid e可通過提高雌激素受體以及成骨關(guān)鍵因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、核心結(jié)合因子1（Cbfa1）、I型膠原（COL1）和堿性磷酸酶（ALP）的大量表達(dá)，促進(jìn)成骨作用。
　?。?）通過動(dòng)物模型評(píng)價(jià)，進(jìn)一步證實(shí)N-benzyl-palmitamide具有抗骨質(zhì)疏松作用。通過構(gòu)建視黃酸致骨質(zhì)疏松大鼠模型，研究了 N-benzyl-pa lmita mid e在動(dòng)物水平的抗骨質(zhì)疏松作用效果，發(fā)現(xiàn) N-benzyl-

8、pa lmita mid e可以提高視黃酸致骨質(zhì)疏松大鼠的股骨和脊椎骨密度，增加其骨灰分和骨鈣含量，改善骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，具有較好的抗骨質(zhì)疏松效果；機(jī)理探索發(fā)現(xiàn)，N-benzyl-palmitamide可以通過促進(jìn)ALP活性，拮抗視黃酸引起的雌激素水平下降和抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）活性上升，實(shí)現(xiàn)其抗骨質(zhì)疏松作用的。
　　（5）比較研究了含有N-benzyl-palmitamide的瑪咖醇提物與N-benzyl-palmitami

9、de單獨(dú)作用效果，發(fā)現(xiàn)在含有相同劑量 N-benzyl-pa lmita mid e條件下，瑪咖醇提物在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、提高股骨和脊椎骨密度、以及改善骨組織物理參數(shù)和形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面的效果，與N-benzyl-pa lmita mide單獨(dú)作用相似，在促進(jìn)ALP活性、提高骨灰分和骨鈣含量方面的效果顯著優(yōu)于 N-benzyl-pa lmita mide單獨(dú)作用，表明瑪咖中N-benzyl-palmitamide是重要的促成骨作用活性成分，

10、同時(shí)也含有其他具有一定抗骨質(zhì)疏松作用或協(xié)同作用的活性成分。在實(shí)驗(yàn)使用劑量下，瑪咖醇提物和N-benzyl-palmita mide均沒有表現(xiàn)出子宮增重等明顯的不良反應(yīng)。
　　綜上，本文采用虛擬篩選技術(shù)結(jié)合MC3T3-E1成骨細(xì)胞以及視黃酸致骨質(zhì)疏松大鼠模型的活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)瑪咖中的N-benzyl-pa lmita mid e具有抗骨質(zhì)疏松活性；其通過提高雌激素受體和成骨關(guān)鍵因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、核心結(jié)合因子1、I型膠原和堿性磷酸酶