仙茅苷抗骨質(zhì)疏松作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 仙茅應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的治療具有悠久的歷史,仙茅苷作為仙茅中主要的活性成分,具有抗骨質(zhì)疏松的藥理活性,但其作用機(jī)制尚不明確。本課題的目的是探索仙茅苷抗骨質(zhì)疏松作用及其作用機(jī)制,旨在發(fā)現(xiàn)仙茅治療骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病有效性的物質(zhì)基礎(chǔ),為仙茅的開發(fā)利用提供分子細(xì)胞水平的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。
　　 2、應(yīng)用MTT法檢測仙茅苷在24h、48h及72h對MC

2、3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。
　　 3、采用茜素紅染色法檢測仙茅苷對MC3T3-E1細(xì)胞骨小結(jié)形成的影響。
　　 4、PNPP法檢測72h、96h時仙茅苷對于MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響。
　　 5、利用實(shí)時熒光定量PCR法檢測仙茅苷對成骨細(xì)胞表達(dá)的BMP-2、OSX、RANKL、OPG mRNA的影響。
　　 6、硝酸還原酶法檢測30d實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)仙茅苷對于MC3T3-E1細(xì)胞NO生成含量的影

3、響。
　　 7、運(yùn)用NO合成阻斷劑L-NAME阻斷NO信號后,觀察仙茅苷對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性、堿性磷酸酶活性、骨小結(jié)形成活性的影響,評價NO在仙茅苷促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞成骨活性中的作用。
　　 8、運(yùn)用雌激素受體阻斷劑ICI182780阻斷雌激素受體通路后,觀察仙茅苷對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性、堿性磷酸酶活性及骨小結(jié)形成活性的影響,同時采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測BMP-2、OSX、RANKL、OPG、E

4、Rα、ERβ mRNA相對表達(dá)量,評價雌激素受體通路在仙茅苷促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞成骨活性中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、確認(rèn)所購細(xì)胞為MC3T3-E1細(xì)胞,具有成骨細(xì)胞的明顯特點(diǎn),并可在分化條件下生成明顯的礦化結(jié)節(jié)。
　　 2、仙茅苷(10-4～10-5mol/L)在24h、48h、72h對成骨細(xì)胞均有顯著的促增殖作用。濃度為10-7 mol/L時促增殖作用在48h、72h表現(xiàn)明顯,濃度為10-8 mol/

5、L在48h時表現(xiàn)有增殖作用。其中48h是最佳作用時間,此時仙茅苷(10-4～10-7mol/L)促增殖作用非常明顯(P<0.001)。
　　 3、仙茅苷促骨小結(jié)形成的最佳濃度為10-9 mol/L。
　　 4、仙茅苷以10-7、10-9mol/L濃度在96h時可顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性。
　　 5、仙茅苷對MC3T3-E1細(xì)胞中BMP-2、OSX、OPG mRNA相對表達(dá)量在30d內(nèi)均有顯著上調(diào)

6、作用,對于RANKL mRNA的表達(dá),在6d、12d時有顯著的抑制作用。
　　 6、仙茅苷對MC3T3-E1細(xì)胞NO合成量無明顯影響。
　　 7、在L-NAME的干預(yù)下,仙茅苷對MC3T3-E1細(xì)胞的促增殖作用無明顯變化,但堿性磷酸酶活性、骨小結(jié)形成等成骨活性顯著下降,此影響系非特異性阻斷作用。
　　 8、仙茅苷對MC3T3-E1細(xì)胞的促增殖、分化及礦化作用及其對BMP-2、OSX、OPGmRNA表達(dá)水平的影響可

7、被雌激素受體阻斷劑ICI182780阻斷；仙茅苷顯著升高ERα的表達(dá),對ERβ無明顯作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、仙茅苷在一定濃度范圍內(nèi)(10-4～10—8mol/L)對MC3T3-E1細(xì)胞有顯著的促增殖作用。
　　 2、仙茅苷促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的分化及礦化作用的最佳濃度為10-9mol/L。
　　 3、仙茅苷促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨活性與NO信號通路無明顯關(guān)聯(lián)。生理狀態(tài)下的NO對成骨細(xì)胞的