骨碎補(bǔ)抗骨質(zhì)疏松活性成分和心葉淫羊藿抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松是以骨的力學(xué)強(qiáng)度減弱為標(biāo)志的骨骼系統(tǒng)紊亂疾病,骨量低、骨易碎、骨組織微環(huán)境退化,其骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著增加；隨著老齡化社會(huì)的到來(lái),骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。中藥用于治療骨折和骨關(guān)節(jié)疾病已經(jīng)有幾千年的歷史。骨碎補(bǔ)始載于唐《本草拾遺》,各地民間廣泛用于補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛等疾??；然而活性成分、物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清楚。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,有溫腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效；動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果和臨床數(shù)據(jù)一致表明心葉淫羊藿(Epim

2、edium brevieornum Maxim.)的總黃酮提取物能夠同時(shí)提高皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨的骨密度和骨強(qiáng)度,并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)生殖系統(tǒng)的副作用。本論文第二章研究骨碎補(bǔ)中抗骨質(zhì)疏松的活性成分；第三章探求心葉淫羊藿黃酮提取物中抗骨質(zhì)疏松的活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。
　　 本論文第二章采用小鼠去卵巢(ovariectomized,OVX)骨質(zhì)疏松模型和體外促成骨樣細(xì)胞增殖的細(xì)胞模型研究骨碎補(bǔ)藥材槲蕨[Drynaria fortunei(K

3、unze)J.Sm]干燥根莖的60％乙醇提取物的抗骨質(zhì)疏松活性,進(jìn)而確定活性部位；首次從骨碎補(bǔ)的活性部位(大孔樹(shù)脂30％、50％和95％乙醇洗脫餾分)分離得到43個(gè)化合物,并通過(guò)理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR等)鑒定了它們的結(jié)構(gòu),分別為柚皮苷(naringin)(1),新北美圣草苷(neoeriocitrin)(2),柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(narigenin-7-O-β

4、—D—glucoside)(3),5,7,3’,5’-四羥基二氫黃酮-7-O-β—D-吡喃葡萄糖苷(5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone7-O-β—D—glucopyranoside)(4),柚皮素(naringenin)(5),5,7,3’,4’-四羥基二氫黃酮(eriodictyol)(6),kushennol F(7),sophoraflavanone G(8),kurarinone(9),leachi

5、anone A(IO),木犀草素-7-O-新橙皮糖苷(luteolin7-O-neohesperidoside)(11),金魚(yú)草素-6-新橙皮糖苷(aureusidin-6-O-neohesperidoside)(12),山柰酚-7-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(kacmpferol-7一O-α-L-arabinofuranoside)(13*),8-異戊烯基山柰酚(8-prenylkaempferol)(14),山柰酚(kaempfer

6、ole)(15),山柰酚-3-O-α-L-毗喃鼠李糖苷(kaempferol-3一O-α—L-rhamnopyranoside)(16),黃芪苷(astraglin)(17),山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-L-呋喃阿拉伯糖苷(kaempferol3-O-β—D-glucopyranoside-7-O-L-arabinofuranoside)(18*),5,7-二羥基色原酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5,7-dihyd

7、roxychromone-7-O-β-D-glucopyranoside)(19),5,7-二羥基色原酮-7-O-新橙皮糖苷(5,7-dihydroxychromone-7-O-neohesperidoside)(20),山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-β-D-glucopyranoside)(21),xanthogaleno

8、l(22),兒茶素 catechin(23),(E)-4-O-β-D-葡萄糖?？Х人醄(E)-4-O-β-D-glucopyranosyl caffeic acid](24),(E)-4-β-D-吡喃葡萄糖基松針?biāo)醄(E)-4-O-β-D-glucopyranosyl sinapoic acid](25),4-O-β-D-吡喃葡萄基阿魏酸苷(4-O-β-D-glucopyranosyl ferulic acid)(26),反式咖啡酸(t

9、rans-caffeic acid)(27),4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香豆酸(4-O-β-D-glucopyranosyl coumaric acid)(28),二氫異阿魏酸(dihydroisoferulicacid)(29),二氫咖啡酸(dihydrocaffeic acid)(30),3,4-二羥基苯甲酸(3,4-dihydroxyl benzoicacid)(31),4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香草酸(4-O-β-D—glu

10、cosyl vanillic acid)(32),5-ethoxy-2-hydroxy-benzoate(33),3-(acetylamino)-4-hydroxy-benzoic acid(34),12-caffeoyldodecanoic acid(35*),β-谷甾醇(β-sitosterol)(36),maltol glucoside07),1,2-benzenedicarboxylic acid diisobutyl este

11、r(38),1,2,3,4,6-五氧沒(méi)食子?；?β-D-葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)(39),1,2,3,4,-四氧沒(méi)食子?；?β-D-葡萄糖(1,2,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D—glucose)(40),2,3,4,6-四氧沒(méi)食子酰基-α-D-葡萄糖(2,3,4,6-tetra—O-galloyl—α-D-glucose)(41),palmarumycin

12、 JCl(42),山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol3-O-α—L-rhamnoside-7-O-β-D-glucopyranoside)(43)。
　　 43個(gè)化合物中,黃酮類化合物24個(gè)、苯丙素和苯甲酸類化合物10個(gè)、鞣質(zhì)3個(gè)、其他類型化合物6個(gè)。其中化合物18、35為新化合物,其余除化合物1、2、24、36外均為首次從該屬(drynaria)植物中分離得到。對(duì)上述化合物

13、,UMR106細(xì)胞MTT及堿性磷酸酶(ALP)實(shí)驗(yàn)顯示黃酮類化合物能夠促進(jìn)UMR106成骨樣細(xì)胞的增殖和分化,而苯丙素和苯甲酸類化合物則不具有上述活性；同時(shí)提取物指紋圖譜顯示黃酮類化合物為活性部位的主要化學(xué)成分,提示黃酮類化合物可能是中藥骨碎補(bǔ)中抗骨質(zhì)疏松的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示骨碎補(bǔ)中的主要活性成分之一柚皮苷能夠顯著增加骨密度和骨強(qiáng)度,并且不促進(jìn)子宮增生。利用選擇性雌激素受體α(ERα)拮抗劑MPP和選擇性雌激素受體β(ERβ

14、)激動(dòng)劑DPN作為工具藥對(duì)柚皮苷促進(jìn)UMR106細(xì)胞ALP活性進(jìn)行信號(hào)通路研究,發(fā)現(xiàn)柚皮苷可能通過(guò)拮抗ERβ,同時(shí)激動(dòng)ERα起到促進(jìn)骨形成的作用。
　　 綜上所述,本論文第二章在確定活性部位的基礎(chǔ)上對(duì)傳統(tǒng)中藥骨碎補(bǔ)藥材槲蕨的化學(xué)成分進(jìn)行了研究,并且闡明了其主要的活性物質(zhì)為黃酮類化合物,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)其主要活性成分之一柚皮苷能夠提高骨密度增加骨強(qiáng)度,且不促進(jìn)子宮增生,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示柚皮苷可能通過(guò)雌激素受體信號(hào)通路促進(jìn)骨形成,該

15、研究為該骨碎補(bǔ)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定了前期研究基礎(chǔ)。
　　 本論文第三章利用HPLC-MS/MS方法對(duì)淫羊藿黃酮提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析,其中92.7％峰面積的化學(xué)成分得已指認(rèn),共鑒定了7個(gè)化合物,均為異戊烯基黃酮苷類化合物。隨后利用HPLC-MS/MS進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該提取物在家兔血清中的代謝產(chǎn)物為淫羊藿次苷Ⅱ和脫水淫羊藿素。在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中比較了代謝前后的化合物對(duì)成骨樣細(xì)胞增殖和分化的影響,其中脫水淫羊藿素促進(jìn)成骨樣細(xì)胞堿性

16、磷酸酶作用最強(qiáng),提示脫水淫羊藿素(Icaritin)可能是淫羊藿黃酮提取物在體內(nèi)發(fā)揮作用的重要活性物質(zhì)。此外,計(jì)算機(jī)輔助模擬受體-配體對(duì)接實(shí)驗(yàn)顯示脫水淫羊藿素可以很好地和ERβ結(jié)合。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)脫水淫羊藿素可以促進(jìn)骨膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性和鈣沉積,拮抗ERβ信號(hào)通路比激動(dòng)ERα的信號(hào)通路更多地參與其中。另外,脫水淫羊藿素能夠促進(jìn)成骨樣細(xì)胞UMR106細(xì)胞分化,抑制破骨樣細(xì)胞RAW264.7形成破骨細(xì)胞,同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的骨吸