骨碎補抗骨質(zhì)疏松活性成分和心葉淫羊藿抗骨質(zhì)疏松作用機制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松是以骨的力學強度減弱為標志的骨骼系統(tǒng)紊亂疾病,骨量低、骨易碎、骨組織微環(huán)境退化,其骨折風險顯著增加；隨著老齡化社會的到來,骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一個全球性的健康問題。中藥用于治療骨折和骨關(guān)節(jié)疾病已經(jīng)有幾千年的歷史。骨碎補始載于唐《本草拾遺》,各地民間廣泛用于補腎強骨、續(xù)傷止痛等疾病；然而活性成分、物質(zhì)基礎和作用機制尚不清楚。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,有溫腎壯陽、強筋骨、祛風濕的功效；動物試驗結(jié)果和臨床數(shù)據(jù)一致表明心葉淫羊藿(Epim

2、edium brevieornum Maxim.)的總黃酮提取物能夠同時提高皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨的骨密度和骨強度,并且沒有發(fā)現(xiàn)對生殖系統(tǒng)的副作用。本論文第二章研究骨碎補中抗骨質(zhì)疏松的活性成分；第三章探求心葉淫羊藿黃酮提取物中抗骨質(zhì)疏松的活性物質(zhì)基礎及其作用機制。
　　 本論文第二章采用小鼠去卵巢(ovariectomized,OVX)骨質(zhì)疏松模型和體外促成骨樣細胞增殖的細胞模型研究骨碎補藥材槲蕨[Drynaria fortunei(K

3、unze)J.Sm]干燥根莖的60％乙醇提取物的抗骨質(zhì)疏松活性,進而確定活性部位；首次從骨碎補的活性部位(大孔樹脂30％、50％和95％乙醇洗脫餾分)分離得到43個化合物,并通過理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜學手段(UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR等)鑒定了它們的結(jié)構(gòu),分別為柚皮苷(naringin)(1),新北美圣草苷(neoeriocitrin)(2),柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(narigenin-7-O-β

4、—D—glucoside)(3),5,7,3’,5’-四羥基二氫黃酮-7-O-β—D-吡喃葡萄糖苷(5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone7-O-β—D—glucopyranoside)(4),柚皮素(naringenin)(5),5,7,3’,4’-四羥基二氫黃酮(eriodictyol)(6),kushennol F(7),sophoraflavanone G(8),kurarinone(9),leachi

5、anone A(IO),木犀草素-7-O-新橙皮糖苷(luteolin7-O-neohesperidoside)(11),金魚草素-6-新橙皮糖苷(aureusidin-6-O-neohesperidoside)(12),山柰酚-7-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(kacmpferol-7一O-α-L-arabinofuranoside)(13*),8-異戊烯基山柰酚(8-prenylkaempferol)(14),山柰酚(kaempfer

6、ole)(15),山柰酚-3-O-α-L-毗喃鼠李糖苷(kaempferol-3一O-α—L-rhamnopyranoside)(16),黃芪苷(astraglin)(17),山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-L-呋喃阿拉伯糖苷(kaempferol3-O-β—D-glucopyranoside-7-O-L-arabinofuranoside)(18*),5,7-二羥基色原酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5,7-dihyd

7、roxychromone-7-O-β-D-glucopyranoside)(19),5,7-二羥基色原酮-7-O-新橙皮糖苷(5,7-dihydroxychromone-7-O-neohesperidoside)(20),山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-β-D-glucopyranoside)(21),xanthogaleno

8、l(22),兒茶素 catechin(23),(E)-4-O-β-D-葡萄糖?？Х人醄(E)-4-O-β-D-glucopyranosyl caffeic acid](24),(E)-4-β-D-吡喃葡萄糖基松針酸[(E)-4-O-β-D-glucopyranosyl sinapoic acid](25),4-O-β-D-吡喃葡萄基阿魏酸苷(4-O-β-D-glucopyranosyl ferulic acid)(26),反式咖啡酸(t

9、rans-caffeic acid)(27),4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香豆酸(4-O-β-D-glucopyranosyl coumaric acid)(28),二氫異阿魏酸(dihydroisoferulicacid)(29),二氫咖啡酸(dihydrocaffeic acid)(30),3,4-二羥基苯甲酸(3,4-dihydroxyl benzoicacid)(31),4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香草酸(4-O-β-D—glu

10、cosyl vanillic acid)(32),5-ethoxy-2-hydroxy-benzoate(33),3-(acetylamino)-4-hydroxy-benzoic acid(34),12-caffeoyldodecanoic acid(35*),β-谷甾醇(β-sitosterol)(36),maltol glucoside07),1,2-benzenedicarboxylic acid diisobutyl este

11、r(38),1,2,3,4,6-五氧沒食子酰基-β-D-葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)(39),1,2,3,4,-四氧沒食子?；?β-D-葡萄糖(1,2,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D—glucose)(40),2,3,4,6-四氧沒食子?；?α-D-葡萄糖(2,3,4,6-tetra—O-galloyl—α-D-glucose)(41),palmarumycin

12、 JCl(42),山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol3-O-α—L-rhamnoside-7-O-β-D-glucopyranoside)(43)。
　　 43個化合物中,黃酮類化合物24個、苯丙素和苯甲酸類化合物10個、鞣質(zhì)3個、其他類型化合物6個。其中化合物18、35為新化合物,其余除化合物1、2、24、36外均為首次從該屬(drynaria)植物中分離得到。對上述化合物

13、,UMR106細胞MTT及堿性磷酸酶(ALP)實驗顯示黃酮類化合物能夠促進UMR106成骨樣細胞的增殖和分化,而苯丙素和苯甲酸類化合物則不具有上述活性；同時提取物指紋圖譜顯示黃酮類化合物為活性部位的主要化學成分,提示黃酮類化合物可能是中藥骨碎補中抗骨質(zhì)疏松的活性物質(zhì)基礎。動物實驗結(jié)果顯示骨碎補中的主要活性成分之一柚皮苷能夠顯著增加骨密度和骨強度,并且不促進子宮增生。利用選擇性雌激素受體α(ERα)拮抗劑MPP和選擇性雌激素受體β(ERβ

14、)激動劑DPN作為工具藥對柚皮苷促進UMR106細胞ALP活性進行信號通路研究,發(fā)現(xiàn)柚皮苷可能通過拮抗ERβ,同時激動ERα起到促進骨形成的作用。
　　 綜上所述,本論文第二章在確定活性部位的基礎上對傳統(tǒng)中藥骨碎補藥材槲蕨的化學成分進行了研究,并且闡明了其主要的活性物質(zhì)為黃酮類化合物,動物實驗結(jié)果證實其主要活性成分之一柚皮苷能夠提高骨密度增加骨強度,且不促進子宮增生,體外細胞實驗提示柚皮苷可能通過雌激素受體信號通路促進骨形成,該

15、研究為該骨碎補的進一步開發(fā)和利用奠定了前期研究基礎。
　　 本論文第三章利用HPLC-MS/MS方法對淫羊藿黃酮提取物進行化學成分分析,其中92.7％峰面積的化學成分得已指認,共鑒定了7個化合物,均為異戊烯基黃酮苷類化合物。隨后利用HPLC-MS/MS進一步研究發(fā)現(xiàn)該提取物在家兔血清中的代謝產(chǎn)物為淫羊藿次苷Ⅱ和脫水淫羊藿素。在體外細胞培養(yǎng)實驗中比較了代謝前后的化合物對成骨樣細胞增殖和分化的影響,其中脫水淫羊藿素促進成骨樣細胞堿性

16、磷酸酶作用最強,提示脫水淫羊藿素(Icaritin)可能是淫羊藿黃酮提取物在體內(nèi)發(fā)揮作用的重要活性物質(zhì)。此外,計算機輔助模擬受體-配體對接實驗顯示脫水淫羊藿素可以很好地和ERβ結(jié)合。體外細胞培養(yǎng)實驗進一步證實脫水淫羊藿素可以促進骨膜細胞堿性磷酸酶活性和鈣沉積,拮抗ERβ信號通路比激動ERα的信號通路更多地參與其中。另外,脫水淫羊藿素能夠促進成骨樣細胞UMR106細胞分化,抑制破骨樣細胞RAW264.7形成破骨細胞,同時抑制破骨細胞的骨吸