肝癌細(xì)胞外泌體的鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目前，臨床上應(yīng)用最廣泛的肝癌血清標(biāo)志物是AFP，而AFP診斷肝癌具有局限性，因而亟待探索發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值而實(shí)用的標(biāo)志物。2013年，James E. Rothman，Randy W. Schekman，Thomas C因發(fā)現(xiàn)細(xì)胞囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)機(jī)制，揭開細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸機(jī)制之謎而榮獲了當(dāng)年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。作為人體內(nèi)一類重要囊泡，外泌體（exosomes）已成為生物標(biāo)志物研究熱點(diǎn)。由于外泌體中含有的特有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA、microRNA

2、等活性物質(zhì)，在細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移等方面發(fā)揮重要作用。目前已從外泌體中發(fā)現(xiàn)多種生物標(biāo)志物，如檢測(cè)外泌體中EGFR、MET、ALK和BRAF可作為肺癌標(biāo)志物，這為肝癌生物標(biāo)志物的研究提供了新思路。
　　由于蛋白質(zhì)是生命功能的直接體現(xiàn)者，蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。對(duì)處于探索階段的外泌體研究來(lái)說(shuō)，關(guān)于外

3、泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目前還很少報(bào)道。為此，本研究探討適合肝癌細(xì)胞外泌體分離的新方案，通過(guò)改良超離法分離純化肝癌細(xì)胞SMMC-7721、正常肝細(xì)胞HL-7702、肝癌血清和正常對(duì)照血清的外泌體，并從形態(tài)學(xué)和特異蛋白等方面進(jìn)行鑒定；利用LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定肝癌細(xì)胞及其外泌體主要蛋白，并進(jìn)行相關(guān)功能分析，為肝癌細(xì)胞外泌體進(jìn)一步研究提供研究基礎(chǔ)。
　　第一章改良超速離心法提取肝癌細(xì)胞外泌體及鑒定
　　目的：探索肝癌細(xì)胞和

4、血清外泌體的提取和鑒定方法，為外泌體的標(biāo)志物的研究提供基礎(chǔ)。
　　方法：連續(xù)適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞,收集細(xì)胞上清液,采用ExoQuick試劑法、ExoQuick試劑結(jié)合超濾法和改良超速離心法三種方法分離、純化培養(yǎng)上清液中肝癌細(xì)胞外泌體；ExoQuick試劑法和超速離心法提取血清外泌體；透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，Nanosight技術(shù)分析粒徑，Western blot分析外泌體特異蛋白Alix、CD63、CD9的表達(dá)

5、；利用SDS-PAGE電泳分析肝癌細(xì)胞和血清外泌體的蛋白譜。
　　結(jié)果：采用ExoQuick試劑法和ExoQuick試劑結(jié)合超濾法提取的外泌體濃度低、純度差；改良超速離心法可分離出純度高的外泌體，透射電鏡觀察肝癌細(xì)胞外泌體,外形呈圓形或橢圓形; Nanosight技術(shù)分析外泌體顆粒直徑峰值為122 nm,直徑30-150 nm之間顆粒占72.16％;Western blot證實(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)上清液和外泌體提取液中均能檢測(cè)到Alix、C

6、D63、CD9的蛋白表達(dá); SDS-PAGE電泳清晰顯示外泌體中高豐度大分子結(jié)構(gòu)蛋白明顯少于肝癌細(xì)胞和血清。
　　結(jié)論：利用連續(xù)適應(yīng)無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合改良超速離心法能提取高純度的外泌體,肝癌細(xì)胞外泌體中高豐度大分子結(jié)構(gòu)蛋白干擾少，有利于標(biāo)志物的研究。
　　第二章肝癌細(xì)胞外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的： LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)蛋白組學(xué)分析鑒定肝癌細(xì)胞SMMC-7721及其外泌體的主要蛋白，生物信息學(xué)分析其功能。

7、　　方法：分離和純化肝癌細(xì)胞SMMC-7721外泌體，通過(guò)LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定肝癌細(xì)胞SMMC-7721及其外泌體的主要蛋白，篩選共同表達(dá)蛋白；運(yùn)用DAVID系統(tǒng)對(duì)共同表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分類分析和信號(hào)傳導(dǎo)通路分析；運(yùn)用String系統(tǒng)對(duì)共同表達(dá)蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)蛋白相互作用分析。
　　結(jié)果：經(jīng)人類uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定，采用高置信度的肽段（大于95%），檢出肝癌SMMC-7721細(xì)胞蛋白4922個(gè)，SMMC-7721外泌

8、體蛋白1568個(gè)，兩者共同蛋白1035個(gè)，其中肽譜圖匹配數(shù)PSMs＞40的相對(duì)高表達(dá)蛋白70個(gè)；在70個(gè)蛋白中外泌體膜蛋白有4個(gè)，分別為肌球蛋白9（Myosin-9，MYH9），視黃酸誘導(dǎo)的蛋白3（Retinoic acid-induced protein3，GPRC5A），整合素β-1（Integrin beta-1，ITGB1），人源重組蛋白（Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase

9、2，GALNT2）；70個(gè)蛋白分類分析顯示，大部分蛋白屬于細(xì)胞器或膜蛋白類（31%）、結(jié)合類（60%）及轉(zhuǎn)移/載體蛋白類（28%）；對(duì)70個(gè)蛋白進(jìn)行信號(hào)通路分析，富集出與肝癌有關(guān)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路2條，分別為基因剪切通路（Spliceosome）和在癌癥通路（Pathways in cancer）； String分析70個(gè)蛋白相互作用，顯示功能節(jié)點(diǎn)蛋白為DHX9、PRKDC、HSP90AA1、ITGB1、AGRN、 RUVBL1、 EEF