重樓總皂苷作用人肝癌細(xì)胞系HepG2的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：通過研究重樓總皂苷(Rhizoma Paridis total saponin，RPTS)對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，尋找RPTS抗腫瘤作用的相關(guān)蛋白。 方法：①按照皂苷提取方法制備RPTS。②MTT比色法檢測RPTS對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)分析RPTS處理HepG2細(xì)胞后凋亡和細(xì)胞周期的改變。③應(yīng)用固相pn梯度(ImmobilizedpH gradie

2、nt，IPG)雙向凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)技術(shù)分離RPTS處理組(IC50濃度作用48h)和對(duì)照組HepG2細(xì)胞的總蛋白，膠體硝酸銀染色，圖像掃描獲取處理組和對(duì)照組總蛋白質(zhì)的2-DE圖譜后，使用ImageMaster軟件分析比較兩組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime

3、-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)測得經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解的差異蛋白點(diǎn)肽質(zhì)量指紋譜(Peptide mass fingerprint，PMr)，用Mascot軟件查詢NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。 結(jié)果：①成功獲取RPTS并經(jīng)TLC、HPLC等方法鑒定。②RPTS對(duì)HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，并呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。MTT法提示RPTS作用HepG2細(xì)胞48h的IC50為10±1.2μg/

4、ml。FCM檢測發(fā)現(xiàn)RPTS能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，引起HepG2細(xì)胞S期阻滯。③根據(jù)MTT分析和FCM檢測結(jié)果，選擇10μg/ml RPTS干預(yù)HepG2細(xì)胞48h進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)分析，所獲2-DE圖譜分辨率較高、重復(fù)性較好。RPTS處理組和對(duì)照組平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為1690±25和1 700±39，平均匹配的點(diǎn)數(shù)分別為1394±17和1421±13，匹配率達(dá)82.5％和83.6％。RPTS處理組與對(duì)照組不同

5、膠之間蛋白質(zhì)點(diǎn)在等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)方向的偏差是1.232±0.218mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)方向上的偏差為1.126±0.142mm。兩組間共有51個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，RPTS處理組有31個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)，20個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)。選擇表達(dá)量差異較明顯的15

6、個(gè)差異點(diǎn)(差異2倍以上)行質(zhì)譜分析，獲得15張PMF圖譜，經(jīng)查詢數(shù)據(jù)庫初步鑒定12個(gè)蛋白質(zhì)，部分蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)展相關(guān)，如dUTP焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase，dUTPase)，異種核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K)，GMP合酶(GMP synthase)，脫氧核糖核酸內(nèi)切酶Y(DNasegamma)，核苷酸二磷酸激酶A(Nuc