重樓總皂苷作用人肝癌細胞系HepG2的蛋白質組學研究.pdf

1、目的：通過研究重樓總皂苷(Rhizoma Paridis total saponin，RPTS)對人肝癌細胞株HepG2蛋白質表達譜的影響，尋找RPTS抗腫瘤作用的相關蛋白。 方法：①按照皂苷提取方法制備RPTS。②MTT比色法檢測RPTS對HepG2細胞增殖的影響，流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)分析RPTS處理HepG2細胞后凋亡和細胞周期的改變。③應用固相pn梯度(ImmobilizedpH gradie

2、nt，IPG)雙向凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)技術分離RPTS處理組(IC50濃度作用48h)和對照組HepG2細胞的總蛋白，膠體硝酸銀染色，圖像掃描獲取處理組和對照組總蛋白質的2-DE圖譜后，使用ImageMaster軟件分析比較兩組間差異表達的蛋白質，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime

3、-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)測得經(jīng)膠內胰酶酶解的差異蛋白點肽質量指紋譜(Peptide mass fingerprint，PMr)，用Mascot軟件查詢NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫。 結果：①成功獲取RPTS并經(jīng)TLC、HPLC等方法鑒定。②RPTS對HepG2細胞增殖具有抑制作用，并呈劑量和時間依賴關系。MTT法提示RPTS作用HepG2細胞48h的IC50為10±1.2μg/

4、ml。FCM檢測發(fā)現(xiàn)RPTS能夠誘導HepG2細胞凋亡，引起HepG2細胞S期阻滯。③根據(jù)MTT分析和FCM檢測結果，選擇10μg/ml RPTS干預HepG2細胞48h進行蛋白質組學(Proteomics)分析，所獲2-DE圖譜分辨率較高、重復性較好。RPTS處理組和對照組平均蛋白質點數(shù)分別為1690±25和1 700±39，平均匹配的點數(shù)分別為1394±17和1421±13，匹配率達82.5％和83.6％。RPTS處理組與對照組不同

5、膠之間蛋白質點在等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)方向的偏差是1.232±0.218mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)方向上的偏差為1.126±0.142mm。兩組間共有51個差異表達蛋白點，RPTS處理組有31個蛋白質點下調，20個蛋白質點上調。選擇表達量差異較明顯的15

6、個差異點(差異2倍以上)行質譜分析，獲得15張PMF圖譜，經(jīng)查詢數(shù)據(jù)庫初步鑒定12個蛋白質，部分蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、進展相關，如dUTP焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase，dUTPase)，異種核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K)，GMP合酶(GMP synthase)，脫氧核糖核酸內切酶Y(DNasegamma)，核苷酸二磷酸激酶A(Nuc