喜樹堿誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究目的： 喜樹堿是從喜樹(珙桐科,喜樹屬)中提取出的五環(huán)生物堿,是拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑,能可逆性地與拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA可裂解復(fù)合物結(jié)合。喜樹堿衍生物伊利替康和拓?fù)涮婵狄褟V泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療,尤其是肝癌?？闪呀獾腄NA-拓?fù)洚悩?gòu)酶-喜樹堿三元復(fù)合物一旦轉(zhuǎn)變成不可裂解復(fù)合物,將導(dǎo)致DNA損傷、DNA修復(fù)機(jī)制的激活,細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)變化和細(xì)胞凋亡等一系列信號通路的改變。這些通路中關(guān)鍵調(diào)控分子的失活極大地影響了癌變過程,并與

2、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的作用密切相關(guān)。以多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)為例,該蛋白參與了DNA修復(fù)機(jī)制,對維持基因穩(wěn)定性有重要作用。喜樹堿可激活PARP的表達(dá),PARP缺失或基因敲除的細(xì)胞很容易發(fā)生癌變,并且對喜樹堿的細(xì)胞毒作用高度敏感,同時PARP抑制劑亦可以增強(qiáng)喜樹堿衍生物的抗腫瘤作用。此外,喜樹堿誘導(dǎo)的細(xì)胞信號通路中,CHK1,CHK2和NF-κB等細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號分子均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,這些功能蛋白的抑制

3、劑同樣可以強(qiáng)化喜樹堿的細(xì)胞毒性,并成為國內(nèi)外腫瘤研究的熱點和難點。因此,在模式體系中進(jìn)一步研究喜樹堿作用后的關(guān)鍵調(diào)控因子,探索可靠、敏感的生物靶標(biāo),有助于完善腫瘤應(yīng)對細(xì)胞毒藥物作用的特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為腫瘤治療奠定堅實的理論基礎(chǔ)。本實驗采用了雙向凝膠電泳的方法對喜樹堿誘導(dǎo)的SMMC-7721肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化進(jìn)行分離和分析,并對喜樹堿誘導(dǎo)半乳糖凝集素-1(Galectin-1)表達(dá)變化的調(diào)控機(jī)制作出了初步的探索。 半乳糖凝集素

4、-1是凝集素家族成員之一,廣泛參與了細(xì)胞生命活動,如調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、免疫逃逸和血管再生等。正常肝臟組織中,Galectin-1幾乎不表達(dá),但是在肝癌細(xì)胞中往往過量表達(dá)。此外利用RNA干擾技術(shù)抑制Galectin-1的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒藥物SN-38(喜樹堿的衍生物)的敏感性得到大幅度增加,而加入重組的Galectin-1后,這種敏感性可以被部分抵消。有報道稱Galectin-1組織特異性表達(dá)與DNA甲基化模

5、式有關(guān),而且在去甲基化作用下,其表達(dá)可得到提高。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)負(fù)責(zé)DNA復(fù)制過程中維持DNA的甲基化模式。因此,DNMTs是否參與了喜樹堿對Galectin-1的表達(dá)調(diào)控,并影響喜樹堿誘導(dǎo)的增殖抑制和細(xì)胞凋亡值得進(jìn)一步研究。 研究方法： 喜樹堿(55μg/ml)處理SMMC-7721肝癌細(xì)胞6小時后,收集喜樹堿處理組和空白對照組的細(xì)胞總蛋白質(zhì),行雙向凝膠電泳(2-D)。電泳圖譜經(jīng)圖像掃描分析后,選取了若

6、干個表達(dá)量大,并且有差異的蛋白質(zhì)點進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。采用熒光定量RT-PCR和Western Blot方法對2-D結(jié)果進(jìn)行驗證,并檢測了喜樹堿對SMMC-7721細(xì)胞Galectin-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。隨后應(yīng)用ELISA法,檢測了喜樹堿對SMMC-7721肝癌細(xì)胞DNMTs表達(dá)的影響。接著通過MTT實驗和流式細(xì)胞術(shù)分析,檢測了DNMTs抑制劑5-脫氧氮雜胞苷、喜樹堿單獨用藥或者聯(lián)合用藥對SMMC-7721細(xì)胞增

7、殖和凋亡的影響。最后檢測了低濃度5-脫氧氮雜胞苷對SMMC-7721細(xì)胞周期分布的影響情況。 結(jié)果： Galectin-1的分離和鑒定 喜樹堿處理SMMC-7721細(xì)胞6小時后,收集細(xì)胞總蛋白行雙向凝膠電泳(2-D),分析喜樹堿處理組和空白對照組的總蛋白質(zhì)的差異。在相同實驗條件下進(jìn)行3次2-D,銀染顯色后得到喜樹堿處理組(實驗組)和對照組SMMC-7721細(xì)胞蛋白質(zhì)的2-D圖譜。PDQuest軟件分析顯示,實驗組

8、蛋白質(zhì)點數(shù)為761±56個,對照組為731±80個,兩塊平均膠的匹配率分別為70％,61％。比較兩組細(xì)胞平均膠的差異(差異2倍以上認(rèn)為有差異),有317個蛋白僅在實驗組細(xì)胞中出現(xiàn),有30個蛋白僅在對照組細(xì)胞中出現(xiàn)；有386個蛋白點在兩組細(xì)胞中均存在,其中在實驗組中表達(dá)量顯著高于對照組的蛋白質(zhì)點有37個；在對照組中表達(dá)量高于實驗組的蛋白質(zhì)點有29個。質(zhì)譜結(jié)果顯示,喜樹堿誘導(dǎo)的某個表達(dá)下降的蛋白為Galectin-1。 Galect

9、in-1表達(dá)的檢測 本實驗運用了實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR和Western免疫雜交技術(shù),測定了喜樹堿刺激后Galectin-1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)變化。結(jié)果顯示喜樹堿(55μg/ml)刺激SMMC-7721細(xì)胞6 h后,Galectin-1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),與比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。 喜樹堿下調(diào)DNMTs的表達(dá) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),喜樹堿可調(diào)控SMMC-7721肝癌細(xì)胞Galec

10、tin-1的表達(dá)變化,但是其具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。據(jù)報道,Galectin-1基因啟動子附近區(qū)域富含GC區(qū),DNA甲基化是該基因表達(dá)重要的調(diào)控機(jī)制。因此DNA甲基化機(jī)制是否參與了喜樹堿誘導(dǎo)的信號通路,并影響Galectin-1的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。ELISA法檢測了喜樹堿(55μg/ml)對SMMC-7721肝癌細(xì)胞DNMTs表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,喜樹堿顯著性地抑制DNMTs的表達(dá)(P<0.05),抑制程度隨著時間延長而增加,并且呈時間

11、依賴性。 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑增強(qiáng)了喜樹堿的細(xì)胞增殖抑制和促凋亡作用 5-脫氧氮雜胞苷(DAC)是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。體外研究證實,它通過去甲基化作用能使多種CpG島過甲基化的抑癌基因重新表達(dá),而恢復(fù)抑癌功能。喜樹堿顯著性地抑制DNMTs的表達(dá),提示喜樹堿的作用機(jī)制與DNA甲基化有關(guān),因此本部分實驗檢測了5-脫氧氮雜胞苷、喜樹堿單獨用藥或者聯(lián)合用藥對SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明,低濃度(0.

12、0228μg/ml)5-脫氧氮雜胞苷并不影響SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡,而同樣濃度喜樹堿對低濃度5-脫氧氮雜胞苷預(yù)處理的SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡的作用明顯高于喜樹堿單獨作用組(P<0.05)。 5-脫氧氮雜胞苷增強(qiáng)喜樹堿細(xì)胞增殖抑制和促凋亡作用與細(xì)胞周期分布無關(guān) 喜樹堿是細(xì)胞周期特異性藥物,主要作用于細(xì)胞S期。大量研究表明,5-脫氧氮雜胞苷影響細(xì)胞周期分布,造成細(xì)胞周期的阻滯,S期和G2/M期的聚集

13、。因此5-脫氧氮雜胞苷增強(qiáng)喜樹堿細(xì)胞增殖抑制和促凋亡作用可能與細(xì)胞周期分布的改變有關(guān)。本實驗檢測了5-脫氧氮雜胞苷(0.0228μg/ml)對SMMC-7721細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果顯示,低濃度5-脫氧氮雜胞苷并未影響SMMC-7721細(xì)胞的周期分布。 結(jié)論： 本實驗建立了一套分辨率高、重復(fù)性好的蛋白質(zhì)組學(xué)方法,并證明了該方法在尋找喜樹堿誘導(dǎo)的相關(guān)下游信號蛋白的有效性和可行性,提供了SMMC-7721肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙

14、向電泳圖譜,比較和分析了喜樹堿誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞后蛋白質(zhì)點的差異,并對差異蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。 本實驗發(fā)現(xiàn)喜樹堿的分子作用機(jī)制中新的下游蛋白,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,并且提示喜樹堿抑制DNMTs的活性,是喜樹堿的分子藥理作用新的重要環(huán)節(jié)。在抑制細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用方面,DNMTs抑制劑5-脫氧氮雜胞苷和喜樹堿聯(lián)合用藥組的效果明顯高于喜樹堿單獨用藥組,提示5-脫氧氮雜胞苷預(yù)處理可以強(qiáng)化喜樹堿對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,為肝