人退變椎間盤軟骨終板干細胞的鑒定及性質研究.pdf

1、背景：
　　 下腰痛(low back pain，LBP)是當今社會中的一種常見疾病。在美國，僅次于上呼吸道感染而居第2位，是導致勞動力喪失的主要原因之一；亞洲國家如中國因為體力勞動者較多，發(fā)病率更高。椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease，DDD)是引起LBP最常見的原因。隨著我國老齡化進程的發(fā)展，DDD越來越成為嚴重影響人們生活、工作的疾病。
　　 目前治療DDD的方法包括保守治療和手術

2、治療。保守治療包括物理治療和藥物治療等，手術治療主要包括髓核摘除術和脊柱融合術。手術治療雖然通過摘除病變的椎間盤組織或者犧牲脊柱局部節(jié)段的活動度來換取癥狀的解除，然而并沒有從根本上解決椎間盤退變所帶來的生物學功能丟失。近年來的同種異體椎間盤移植和人工椎間盤置換雖然展現(xiàn)出良好的應用前景，然而與這些技術相關的許多并發(fā)癥和缺陷依然需要克服，并且沒有從根本治愈或恢復椎間盤(intervertebral disk，IVD)生理功能。因此，理想的治

3、療DDD的方法是既能緩解疼痛癥狀，又能恢復IVD的結構和生理功能。
　　 近年來隨著生物學治療的迅速發(fā)展，使得外科學進入“再生修復”時代。組織工程療法、細胞療法已成為治療DDD的理想方案，為DDD的治療開辟了一條嶄新的生物之路。但是所有這些治療方法都面臨著同樣的問題：植入組織或細胞的營養(yǎng)供應。在IVD中，軟骨終板是髓核營養(yǎng)供給的重要結構。為此眾多學者認為軟骨終板的退變是引起DDD的使動和發(fā)展因素。因此，保持終板組織正常的生理結構

4、和功能、預防和治療軟骨終板退變才是確保上述療法成功、預防DDD發(fā)生的關鍵。軟骨終板中細胞的減少會導致終板退變，因此刺激軟骨終板組織中的原位干細胞增殖、分化并合成細胞外基質(extracellular matrix，ECM)才是解決上述問題的關鍵。
　　 目的：
　　 本實驗通過獲取人退變椎間盤軟骨終板組織，并消化、分離軟骨終板，提取軟骨終板細胞，分離的軟骨終板細胞經過瓊脂糖篩選后進行體外和動物體內實驗，證實人退變的軟骨終

5、板組織中存在具有向成軟骨、成骨、成脂方向分化的干細胞。并且通過與骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchyme stem cells，BM-MSCs)在形態(tài)、增殖活性、細胞周期、干細胞表面標記物和體外多系誘導分化的能力，從而進一步明確退變軟骨終板干細胞(cartilage endplate derived stem cells，CESCs)的特征，為以后生物學功能的研究打下基礎。
　　 方法：
　　 收集

6、因腰椎間盤退變性疾病行腰椎間盤摘除術并植骨融合的標本。在解剖顯微鏡下清理軟骨終板組織，并消化軟骨終板，提取軟骨終板細胞。獲得的軟骨終板細胞經過瓊脂糖三維篩選系統(tǒng)培養(yǎng)后，選取細胞克隆團并進行體外擴增，擴增后的細胞行流式細胞術檢測干細胞標志物、克隆形成、多系誘導分化及相關檢測證實退變軟骨終板中存在干細胞。經過瓊脂糖篩選并擴增的細胞同羥基磷灰石復合后進行動物體內誘導實驗，并通過組織染色、免疫組化等技術明確可以體內誘導成骨。為了進一步明確CES

7、Cs的具體性質，同來自同一個體的BM-MSCs在細胞增殖能力、干細胞表型、細胞周期、成骨能力、成脂能力、成軟骨能力等方面進行比較，從而進一步明確CESCs的具體性質。典型的圖片用來表示定性結果，應用SPSS10.0軟件作統(tǒng)計學處理，定量結果采用Student-t進行分析。以P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.共聚焦免疫熒光提示退變椎間盤軟骨終板組織中存在干細胞標志物STRO1、CD105、CD73

8、、CD90陽性的細胞。從退變椎間盤軟骨終板中分離出來的細胞進過瓊脂糖篩選培養(yǎng)6周后，可見部分細胞可以形成克隆團，克隆團體外擴增培養(yǎng)后可以貼壁生長、形成細胞克隆、干細胞免疫表型(CD90、CD73、STRO1、CD105)表達為陽性，而CD14，CD19，CD34，CD45和HLA-DR表達量為陰性。體外三系誘導的組織學和基因鑒定結果證實分離出來的細胞可以進行成骨、成脂、成軟骨方向誘導分化。軟骨終板干細胞進行成骨和成脂誘導前后逆轉錄聚合酶

9、鏈反應(reverse transcripdon polymerase chain reaction，RT-PCR)結果表明問充質來源的干細胞標志物在誘導后明顯減少，而胚胎干細胞來源的標志物在誘導前后無明顯變化，說明軟骨終板來源的干細胞主要是間充質性的干細胞，而非胚胎來源的干細胞。
　　 2.體內實驗HE染色可見羥基磷灰石的孔隙中含有紅染的均勻的基質。甲苯胺藍染色提示具有異染的軟骨基質形成。免疫組織化學結果證實Ⅰ、Ⅹ型膠原(co

10、llagen typeⅠ、Ⅹ，ColⅠ、ColⅩ)在組織中表達豐富，而Ⅱ型膠原(collagen type，ColⅡ)在組織中表達量較少。
　　 3.CESCs與BM-MSCs在細胞形態(tài)、細胞增殖能力、細胞周期、細胞免疫表型、三系誘導分化中具有相似的性質。
　　 4.分離出來的CESCs干細胞表型中CD105、CD166表達量低。在成骨能力上，通過對CESCs和BM-MSCs在礦物結節(jié)定量分析、堿性磷酸酶活性(alkal

11、ine phosphatase activities，ALP)比較、成骨特異性基因比較的結果表明CESCs在成骨誘導的早期和晚期具有較強的成骨能力。在成脂能力上，BM-MSCs和CESCs無明顯差異，但是，BM-MSCs成脂誘導過程中具有較大的變異性。在軟骨誘導中，通過比較細胞球濕重、阿利新藍密度、成軟骨特異性基因表達量以及蛋白印跡(western blot，WB)，結果均表明CESCs具有較強的軟骨形成能力。
　　 結論：