胰島β細胞系中SHIP2表達及多態(tài)性與2型糖尿病的關系研究.pdf

1、糖尿病是由多種原因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病。全球糖尿病的患病人數(shù)逐年增加，2010年已超過2億，目前我國糖尿病患者已經(jīng)超過4千萬，其中2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)患者占到90％以上。
　　隨著分子生物學及臨床醫(yī)學研究的不斷進步，近年來對T2DM發(fā)病機制的研究有了很大進展，尤其是在胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙這兩個方面，從而為T2DM的診斷和治療做出了很大貢獻。肥胖作為T2

2、DM發(fā)生和發(fā)展中最主要的危險因素之一，顯著特征是患者體內(nèi)游離脂肪酸水平(Free fatty acid，F(xiàn)FA)持續(xù)升高；血漿FFA濃度的升高不僅可以增加周圍組織的胰島素抵抗，同時還能損害β細胞功能，抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)和β細胞增殖，誘導β細胞凋亡，降低β細胞數(shù)量，最終導致糖尿病的發(fā)生發(fā)展。磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinosit

3、ol3-kinase，pI3K/Akt)通路是胰島素主要的信號傳導通路。SHIP2基因是目前新發(fā)現(xiàn)的一種磷酸酶，是PI3K/Akt信號通路的負調(diào)控因子。有關SHIP2基因在胰島素分泌及糖尿病發(fā)病中的作用，尤其是有關臨床方面的研究國內(nèi)外尚無報道。本研究擬檢測SHIP2基因在胰島β細胞中的表達，探討SHIP2基因對胰島β細胞胰島素分泌的作用及其多態(tài)性和2型糖尿病的關系。共分三部分：(1)RT-PCR及Western blot檢測棕櫚酸(Pa

4、lmitate acid，PA)干預的胰島β細胞中胰島素分泌及SHIP2基因表達的變化；(2)應用干擾RNA技術封閉胰島β細胞系中SHIP2基因后觀察SHIP2基因沉默對胰島β細胞胰島素分泌功能及Akt磷酸化水平的變化來了解SHIP2在影響細胞增殖中的機制；(3)利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism，PC

5、R-RFLP)技術檢測SHIP2基因的SNP3和SNP5兩個基因型，探討SHIP2基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關性。
　　第一部分游離脂肪酸干擾胰島βTC3后SHIP2表達及生物學意義
　　目的：探討FFA誘導β細胞損傷的機制，并以棕櫚酸作為誘導因素建立游離脂肪酸誘導的β細胞損傷模型，檢測SHIP2基因在FFA誘導β細胞損傷中的表達變化。
　　方法：應用不同濃度(0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmo

6、l/L)的棕櫚酸處理β細胞，構建FFA誘導β細胞凋亡模型。利用MTT檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡，免疫細胞化學和Western blot檢測β細胞中SHIP2蛋白的表達，RT-PCR檢測棕櫚酸處理后SHIP2 mRNA表達變化，放免法檢測棕櫚酸干預后胰島β細胞的胰島素分泌變化。
　　結果：
　　1 MTT結果顯示，以不同濃度棕櫚酸干預的β細胞表現(xiàn)為增殖受抑，增殖指數(shù)減低，與未干預組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.01)

7、。且隨棕櫚酸干預濃度增加，β細胞增殖率逐漸降低，且其作用呈劑量依賴性。
　　2流式細胞術檢測結果顯示，對照組β細胞的凋亡率為(3.03±0.03)％；0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L的棕櫚酸作用24 h后βTC3細胞凋亡率分別為(4.97±0.14)％、(11.07±0.48)％、(22.43±1.01)％，即隨著作用濃度的升高凋亡率逐漸增加，且明顯高于對照組，各組間相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0

8、5)。
　　3 Western blot分析結果顯示，與對照組相比，棕櫚酸干預的β細胞SHIP2蛋白表達增加，且隨著棕櫚酸濃度升高，SHIP2蛋白表達逐漸增強(P<0.05)。免疫細胞化學分析發(fā)現(xiàn)，SHIP2表達于β細胞胞漿，呈棕黃色顆粒狀；未處理組表達較弱。棕櫚酸干預后，隨干預濃度增加β細胞胞漿內(nèi)SHIP2表達逐漸增強。
　　4 RT-PCR結果表明，與對照組相比，棕櫚酸處理后，β細胞中SHIP2mRNA的表達水平上升，并

9、且隨著藥物作用濃度增加而升高，提示棕櫚酸可誘導β細胞SHIP2 mRNA表達，SHIP2 mRNA表達水平與棕櫚酸劑量呈現(xiàn)量效關系。
　　5棕櫚酸干預組β細胞p-Akt473水平明顯低于未處理組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且隨著棕櫚酸干預濃度升高，p-Akt水平逐漸降低，呈劑量依賴性。Akt表達水平在各組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　6放免法檢測胰島素濃度，結果顯示，β細胞經(jīng)不同濃度的棕櫚酸孵育24 h后，2

10、.8 mmol/L葡萄糖刺激的胰島素分泌隨棕櫚酸干預濃度升高逐漸增加，而22.4 mmol/L葡萄糖刺激的胰島素分泌隨棕櫚酸干預濃度升高逐漸減少，提示胰島素分泌與棕櫚酸濃度呈現(xiàn)出劑量依賴性。
　　結論：棕櫚酸明顯抑制胰島β細胞增殖，促進其凋亡，降低葡萄糖刺激胰島β細胞的胰島素分泌；其機制可能通過增強SHIP2蛋白表達，抑制Akt磷酸化。
　　第二部分 SHIP2基因在胰島β細胞中表達變化的機制探討
　　目的：通過RNA

11、干擾技術沉默胰島β細胞SHIP2基因，觀察胰島β細胞在SHIP2基因缺失后其生物學效應的變化并探討其機制。
　　方法：檢測β細胞目的基因SHIP2表達并進行轉染條件優(yōu)化；設計和合成三條Stealth siRNA片段，通過QPCR方法檢測Stealth siRNA對靶基因的干擾效果，Western blot檢測SHIP2蛋白進行轉染鑒定；實驗分為三組：A組：βTC3、B組：βTC3+脂質(zhì)體-Lipo2000復合物和C組：βTC3+脂

12、質(zhì)體-Lipo2000復合物+Stealth siRNA-2，MTT檢測胰島β細胞的增殖情況，流式細胞術檢測各組細胞凋亡變化，Western blot檢測各組細胞SHIP2、p-Akt473及Akt表達變化，放免法檢測2.8 mmol/L和22.4 mmol/L兩種濃度葡萄糖刺激后各組胰島素的分泌情況。
　　結果：
　　1 SHIP2基因在βTC3細胞中有表達。Oligo轉染靶細胞后24 h，F(xiàn)組(Oligo：Lipo200

13、0為25pmol：1.5μl)的熒光比例相對較高，Ⅰ組(Oligo：Lipo2000為50pmol/1.5μl)熒光比例與F組相當，但是轉染后部分細胞死亡，因此選擇F組的轉染條件Oligo：Lipo2000為25pmol：1.5μl作為后續(xù)實驗條件。
　　提取轉染siRNAs24 h后各組細胞的總RNA，用QPCR測定SHIP2基因表達情況。與對照組相比，siRNA-1、2、3組βTC3細胞SHIP2 mRNA表達經(jīng)bandsca

14、n掃描分析基因沉默效率分別為-523％、46.6％和-97.2％，其中以siRNA-2組干擾有效果；內(nèi)參GAPDH mRNA表達各組基本相同。
　　2與對照組相比，空載體轉染組SHIP2蛋白的表達未見明顯變化，而SHIP2 siRNA-2組SHIP2蛋白表達水平明顯下降。
　　3 SHIP2基因沉默促進β細胞增殖MTT檢測表明：C組與A、B兩組相比較，轉染后β細胞增殖明顯增加，其作用隨著作用時間延長而增強，轉染48 h促進細

15、胞生長作用達高峰，這種促增殖作用持續(xù)到轉染后72 h。而B組和A組細胞仍增殖緩慢，它們和C組的差異加大，曲線分離加劇。(P<0.05)。
　　1 SHIP2基因沉默對β細胞凋亡的影響流式細胞學檢測凋亡發(fā)現(xiàn)C組TC3細胞48 h的凋亡率為(3.89±0.023)％，略低于A組[(3.91±0.021)％]和B組[(3.98±0.025)％]，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　2 SHIP2基因沉默β細胞Akt磷酸化水平變化

16、，Western blot結果顯示，磷酸化Akt473表達水平在C組較A、B兩組表達明顯增高(P<0.05)，A和B組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，總Akt的蛋白表達水平在三組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　32.8 mmol/L濃度葡萄糖的KRB緩沖液孵育后β細胞胰島素分泌在三組之間沒有差異(P>0.05)。22.4 mmol/L濃度葡萄糖的KRB緩沖液孵育后各組均產(chǎn)生了高糖刺激后的胰島素分泌，C組的胰島素分泌量增加，

17、與A、B組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。A組與B組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　結論：針對SHIP的干擾RNA能有效抑制β細胞中SHIP2基因的表達；SHIP2基因沉默導致胰島β細胞中Akt磷酸化水平上調(diào)，β細胞增殖能力增強，胰島素分泌增加；SHIP2基因表達受抑不能使βTC3細胞的凋亡率有顯著降低。
　　第三部分 SHIP2基因多態(tài)性和2型糖尿病的相關性研究
　　目的：本研究基于河北地區(qū)漢族人群的遺

18、傳背景，研究探討SHIP2基因SNP3(+1893/1894AA/CC)和SNP5(+2945A/G)與2型糖尿病的相關性，探索SHIP2基因與2型糖尿病發(fā)關系。
　　方法：選取符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病診斷標準的河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院的2型糖尿病住院患者376例；正常健康人(設立對照組)382例。所有人群對本次研究知情同意并自愿參加，采取外周靜脈血應用基因柱吸附法提取DNA，利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(

19、PCR-RFLP)技術檢測SHIP2基因SNP3和SNP5兩個基因型，計算其基因型分布及等位基因頻率并進行比較。
　　結果：
　　1 Hardy-Weinberg平衡檢驗對病例組和對照組的基因型頻數(shù)分布分別進行擬和優(yōu)度X2檢驗，結果表明：各位點基因型在各組中的頻數(shù)分布均符合H-W平衡定律(P>0.05)。
　　2 SHIP2基因多態(tài)性在T2DM組與對照組中基因型和等位基因的頻數(shù)分布：
　　2.1 SHIP2基因S

20、NP3(+1893CC/AA)位點在T2DM組/正常對照組中的分布為：AA型23/13(6.1％/3.4％)；CC型273/315(72.6％/82.5％)；CA型80/54(21.3％/14.1％)；A和C等位基因在T2DM組/正常對照組中的分布為：A等位基因146/80(18.9％/10.5％)；C等位基因626/684(81.1％/89.5％)；各基因型頻率和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(均P>0

21、.05)SNP3位點AA、CC、AC基因型在T2DM患者組和正常對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(X2=10.78，P=0.00)；等位基因頻率分布經(jīng)X2檢驗在兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義(X2=21.80，P=0.00)；
　　2.2 SHIP2基因SNP5位點經(jīng)X2檢驗在T2DM患者組和正常對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(X2=2.42、P=0.30，X2=3.21、P=0.07)。
　　3各基因型間在T2DM組與對照組臨床表型特

22、征的比較：
　　3.1 SNP3單因素方差分析，對照組內(nèi)CC基因型較CA、AA基因型在腰臀比(WHR)水平差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其余臨床指標差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。
　　3.2 SNP5單因素方差分析，對照組中AA基因型在體重指數(shù)水平上較GG型明顯下降，且有統(tǒng)計學意義，其余指標差別均無統(tǒng)計學意義。
　　4 T2DM組中高血壓組與非高血壓組各基因型與等位基因頻率分布：
　　SHIP2基因S

23、NP3(+1893CC/AA)基因型分布：CC型195/142(88.6％/91.0％)、CA型24/12(10.9％/12％)、AA型1/2(0.5％/2％)三個基因型間無差別(X2=1.828，P=0.401)。等位基因C為414/296(94.1％/94.9)，等位基因A為26/16(5.9％/5.1％)，兩者之間無差別(X2=0.211，P=0.646)。各基因型與高血壓可能無關。
　　結論：
　　1 T2DM組與正

24、常對照組中SHIP2基因SNP3(+1893CC/AA)各基因型和等位基因頻率在兩組間差別有統(tǒng)計學意義，提示其可能是糖尿病的保護因素。
　　2 SHIP2基因+2945A/G各基因型和等位基因頻率差別無統(tǒng)計學意義，結果提示SHIP2基因+2945A/G多態(tài)性可能與2型糖尿病無相關性，提示SHIP2基因+2945A/G多態(tài)性與2型糖尿病無相關性。
　　3 SHIP2基因+2945A/G，攜帶G等位基因的2型糖尿病患者易發(fā)生高血