Smad4介導(dǎo)TGF-β2-BMP2信號對心臟發(fā)育相關(guān)基因組蛋白乙?;揎椪{(diào)控作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本研究分為三部分:
  第一部分:Smad4低表達(dá)對H9C2心肌細(xì)胞心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及其組蛋白乙?;揎椀挠绊?br>  目的:
  構(gòu)建Smad4低表達(dá)的細(xì)胞模型,檢測Smad4對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2c,Tbx5,Nkx2.5的表達(dá)的影響,并檢測其對組蛋白H3乙酰化及這些基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;降挠绊?。以證實我們的科學(xué)假設(shè): Smad4對組蛋白乙酰化修飾具有調(diào)節(jié)作用。
  方法:

2、>  (1)構(gòu)建3條低表達(dá)Smad4的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞建立Smad4干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,然后從蛋白水平檢測Smad4蛋白的表達(dá),檢測其干擾效果,篩選出干擾效果最好的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)試驗。
  (2)實驗分為正常對照組,陰性對照組(空載慢病毒組)和Smad4干擾組,實時熒光定量PCR檢測三組心臟發(fā)育相關(guān)基因GATA4,NKX2.5,MEF2c,Tbx5,以及組蛋白乙酰化酶(HATs)亞型p300和GCN5的mRNA表達(dá)情

3、況,Western-blotting檢測乙酰化組蛋白H3(acH3)的表達(dá),ChIP-Real-Time Q-PCR檢測各處理組細(xì)胞GATA4,Nkx2.5,MEF2c,Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;健?br>  結(jié)果:
  (1)用第2條干擾序列包裝成的Smad4干擾慢病毒轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞以后,Smad4蛋白表達(dá)水平明顯下降,抑制率為86.8%。
  (2)與正常對照組及陰性對照組相比,Smad4干擾組的心臟核心

4、轉(zhuǎn)錄因子GATA4,Nkx2.5表達(dá)降低(P<0.05),MEF2c,Tbx5以及HATs亞型p300和GCN5的表達(dá)無明顯變化。
  (3)與對照組相比,Smad4干擾組心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4,Nkx2.5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;浇档?,MEF2c,Tbx5無明顯變化。Smad4干擾組心肌細(xì)胞總體的組蛋白H3乙?;綗o明顯變化。
  結(jié)論:
  (1)成功構(gòu)建了針對H9C2心肌細(xì)胞中干擾Smad4基因表達(dá)的慢

5、病毒載體,為后續(xù)試驗中驗證Smad4的關(guān)鍵作用奠定基礎(chǔ)。
  (2) GATA4和Nkx2.5啟動子區(qū)組蛋白H3乙酰化水平降低可能導(dǎo)致GATA4和Nkx2.5的mRNA表達(dá)下降,而Smad4表達(dá)水平降低可能是導(dǎo)致GATA4,Nkx2.5啟動子區(qū)乙酰化水平降低的機(jī)制之一。
  第二部分: Smad4介導(dǎo)BMP2信號通路對心肌細(xì)胞組蛋白乙?;揎椀恼{(diào)控作用及其機(jī)制研究
  目的:
  在阻斷Smad4基因表達(dá)的基礎(chǔ)上

6、,激活其上游的信號分子BMP2,觀察BMP2對下游心臟發(fā)育相關(guān)基因及乙?;降挠绊懀瑥亩炞C我們的科學(xué)假說:Smad4介導(dǎo)了BMP2對心臟發(fā)育相關(guān)組蛋白乙?;揎椀恼{(diào)節(jié)作用。
  方法:
  (1)用腺病毒AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h,48h,72h后,檢測BMP2下游基因GATA4,Nkx2.5的表達(dá),篩選合適的作用時間點。
  (2)選擇好合適的時間點后,用腺病毒AdBMP2和AdGFP分別轉(zhuǎn)染H9c2

7、空白組(Blank組),陰性對照組(NC組)以及Smad4干擾慢病毒組(Lv-Smad4組),檢測心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5,以及HATs亞型p300,GCN5的mRNA表達(dá)情況。
  (3)檢測心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙?;?。
  (4)檢測心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5啟動子區(qū)的組蛋白H3的乙?;健?br>  結(jié)果:
  (1) AdBMP2

8、分別轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h、48h、72h后,心臟核心轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯升高(P<0.05),并于轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到高峰。
  (2)在Smad4低表達(dá)的心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AdBMP2后,與單獨AdBMP2轉(zhuǎn)染組相比,GATA4,Nkx2.5以及HATs亞型p300的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05),而MEF2c,Tbx5的mRNA表達(dá)未受影響。GCN5的mRNA表達(dá)水平在各個處理組間無

9、明顯變化。
  (3) AdBMP2處理組可提高心肌細(xì)胞總體組蛋白H3乙?;剑赟mad4低表達(dá)的心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AdBMP2后,與單獨AdBMP2處理組相比總組蛋白H3乙?;较陆?。
  (4) AdBMP2轉(zhuǎn)染Smad4低表達(dá)后的心肌細(xì)胞,與單獨AdBMP2處理組相比,GATA4,Nkx2.5的基因啟動子區(qū)的組蛋白H3乙酰化水平明顯下降(P<0.05),MEF2C,Tbx5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;絼t無明顯差別。<

10、br>  結(jié)論:
  (1) BMP2可促進(jìn)心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2C,Nkx2.5,Tbx5的mRNA表達(dá)量。
  (2) BMP2可以提高H9c2心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙?;?,在Smad4低表達(dá)以后,BMP2對組蛋白H3乙?;缴险{(diào)作用受到限制,提示在BMP2引起的組蛋白修飾中,Smad4具有關(guān)鍵作用。
  (3) BMP2可以提高組HATs亞型p300的表達(dá),并且可通過提高GATA4,MEF

11、2c,Nkx2.5,Tbx5啟動子區(qū)的乙?;綇亩岣哌@些基因的表達(dá)。而在此基礎(chǔ)上將Smad4低表達(dá)后,HATs亞型p300,以及GATA4,Nkx2.5基因啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;郊捌浠虻谋磉_(dá)水平均較單獨AdBMP2處理組均有下降,說明HATs亞型p300可能參與了BMP2對心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4,Nkx2.5啟動子區(qū)組蛋白H3乙?;降男揎椬饔茫鳶mad4可能介導(dǎo)BMP2對p300的調(diào)控作用,而MEF2c,Tbx5的

12、表達(dá)水平及乙?;讲⑽词艿絊mad4低表達(dá)的干擾,提示還可能存在其他分子介導(dǎo)這一過程。
  第三部分 Smad4介導(dǎo)TGF-β2信號通路對心肌細(xì)胞組蛋白乙?;揎椀恼{(diào)控作用及其機(jī)制研究
  目的:
  在阻斷Smad4基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,激活其上游的信號分子TGF-β2,觀察TGF-β2對下游心臟發(fā)育相關(guān)基因及乙?;降挠绊?,從而驗證我們的科學(xué)假說:Smad4介導(dǎo)了TGF-β2對心臟發(fā)育相關(guān)組蛋白乙?;揎椀恼{(diào)節(jié)作用

13、。
  方法:
  (1)用不同濃度(5μg/L,10μg/L,20μg/L,40μg/L)的人重組轉(zhuǎn)化生長因子rhTGF-β2干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞24h,48h,72h,提取細(xì)胞總RNA檢測TGF-β2下游基因GATA4,MEF2c的mRNA表達(dá),篩選合適的濃度與時間。
  (2)用重組生長因子TGF-β2分別干預(yù)H9C2空白組,陰性對照組,Smad4干擾組細(xì)胞,檢測心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2c,Nkx2.

14、5,Tbx5,以及乙?;竝300,GCN5的mRNA表達(dá)情況。
  (3) WB方法檢測心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙?;健?br>  (4)染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)方法檢測心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5啟動子區(qū)的組蛋白H3乙?;?。
  結(jié)果:
  (1)與對照組相比,經(jīng)TGF-β2干預(yù)后的心肌細(xì)胞,GATA4和MEF2c的mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.05),且在48小時,

15、20μg/L時達(dá)到峰值。
  (2)TGF-β2干預(yù)Smad4低表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞后,與單獨TGF-β2干預(yù)組相比,GATA4,Nkx2.5的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05),MEF2c的表達(dá)在這兩組間無明顯變化,而Tbx5,乙?;竝300和GCN5的mRNA表達(dá)水平在各個處理組間均無明顯變化。
  (3) TGF-β2可提高心肌細(xì)胞總體組蛋白H3乙酰化水平。經(jīng)慢病毒Smad4干擾處理后的心肌細(xì)胞,再過表達(dá)TGF-β

16、2后,與單獨TGF-β2處理組相比,心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙?;较陆?。
  (4)TGF-β2干預(yù)Smad4低表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞后,與單獨TGF-β2干預(yù)組相比,GATA4,Nkx2.5的基因啟動子區(qū)的組蛋白H3乙?;矫黠@下降(P<0.05),MEF2c啟動子區(qū)域乙酰化水平在兩組之間差異不大,Tbx5在各組間的表達(dá)沒有變化。
  結(jié)論:
  (1)TGF-β2可促進(jìn)心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4,MEF2C

17、,Nkx2.5的表達(dá),對Tbx5及乙?;竝300,GCN5表達(dá)沒有影響。
  (2)TGF-β2可以提高細(xì)胞總體組蛋白H3乙?;?,但用TGF-β2處理Smad4低表達(dá)的細(xì)胞后,總的組蛋白H3乙?;讲辉偕?,提示在TGF-β2參與的組蛋白修飾中Smad4起到了關(guān)鍵作用。
  (3) TGF-β2通過提高GATA4,MEF2c,Nkx2.5啟動子區(qū)的組蛋白H3乙?;綇亩岣哌@些基因的表達(dá),但是TGF-β2引起的GA

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