組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300在ALAS2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用及組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c激活A(yù)LAS2基因轉(zhuǎn)錄的機制.pdf

1、紅系特異的5-氨基酮戊酸合成酶(ALAS2)是紅系細胞血紅素生物合成的限速酶。ALAS2的缺失能導(dǎo)致紅細胞發(fā)育的停滯，ALAS2基因的遺傳性突變能引起x-連鎖的成高鐵紅細胞貧血(xLSA)。ALAS2基因的表達在紅細胞發(fā)生過程中顯著增加以滿足血紅蛋白合成增加時對更多血紅素的需求。ALAS2基因的表達主要在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平被調(diào)控。 本論文用組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c和TSA處理紅白血病細胞K562，反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PC

2、R)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ALAS2基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，同時伴隨著ALAS2基因啟動子組蛋白H4乙?；降纳?。ChIP實驗進一步表明組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300能夠與ALAS2基因啟動子結(jié)合。細胞轉(zhuǎn)染和報告基因分析結(jié)果顯示：p300在細胞內(nèi)過量表達既能提高ALAS2基因啟動子報告基因的轉(zhuǎn)錄活性，又能提高細胞內(nèi)源ALAS2基因mRNA水平。用p300的突變體p300△HAT(乙酰轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域缺失)代替p300重復(fù)

3、上述實驗發(fā)現(xiàn)p300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性在激活A(yù)LAS2基因轉(zhuǎn)錄過程中是必要的。另外，我們還通過電泳遷移率(EMSA)實驗確定ALAS2基因啟動子上兩個新的Spl結(jié)合位點。報告基因染色質(zhì)免疫沉淀(reporter ChIP)實驗結(jié)果顯示：P300和GATA-1共轉(zhuǎn)染細胞使ALAS2野生型基因啟動子處的組蛋白H4乙?；缴撸瑢ATA-1位點突變的啟動子組蛋白乙?；綗o明顯影響。位點突變體報告基因分析表明ALAS2基因啟動子上的兩個GAT

4、A-1位點和所有的Spl位點都參與了p300的招募。我們的工作確定了ALAS2基因是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300／CBP的一個靶基因。 另一方面，我們研究了組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c(NaBu)激活A(yù)LAS2基因轉(zhuǎn)錄的機制。我們發(fā)現(xiàn)NaBu不僅能上調(diào)紅系細胞ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄，而且能激活非紅系細胞ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄。同時ALAS2基因啟動子的組蛋白H3乙?；揭约敖M蛋白H3的第4位賴氨酸的雙甲基化水平升高。以啟動子報告

5、基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，然后用含有NaBu的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，結(jié)果表明NaBu能以劑量依賴的方式增強ALAS2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性。以各種位點突變體報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，再用NaBu處理發(fā)現(xiàn)，任何一個Spl位點的突變都會不同程度地降低NaBu對ALAS2基因啟動子的激活作用，當(dāng)所有的Spl位點都突變時，NaBu對ALAS2基因啟動子的激活作用大大降低。因此，我們相信ALAS2基因啟動子上的Spl位點是NaBu的應(yīng)答元件，即Spl位點至少部分地介導(dǎo)

6、了NaBu對ALAS2基因轉(zhuǎn)錄的激活。染色質(zhì)免疫沉淀實驗還發(fā)現(xiàn)。NaBu的處理能增加ALAS2基因啟動子上Spl因子的結(jié)合。進一步研究發(fā)現(xiàn)：組蛋白去乙?；窰DACl能抑制ALAS2基因啟動子的活性，它還能逆轉(zhuǎn)Spl和p300對ALAS2基因啟動子的協(xié)同激活作用。ChIP實驗證實了ALAS2基因啟動子上有：HDACl的結(jié)合，免疫共沉淀(CoIP)分析表明Spl和HDACl存在于同一復(fù)合物中。因此，我們認為轉(zhuǎn)錄因子Spl能招募去乙?；窰

7、DACl抑制ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄，推測HDAC抑制劑NaBu通過抑制HDACl的活性促進ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄。 總之，可逆的組蛋白乙?；揎梾⑴c了ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。紅系特異的轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和遍在因子Sp1共同招募組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300，激活A(yù)LAS2基因的轉(zhuǎn)錄，Sp1還能招募組蛋白去乙?；窰DAC1抑制ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄。p300活性和HDAC1活性的動態(tài)平衡決定了ALAS2基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。 本論