Smad4基因小RNA干擾對(duì)小鼠骨骼肌急性鈍挫傷愈合影響的研究.pdf

1、在骨骼肌損傷修復(fù)的過(guò)程中，TGFβ是影響骨骼肌纖維化的主要細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，它不僅引起損傷骨骼肌纖維化，在肺、腎、肝、皮膚的纖維化過(guò)程中也發(fā)揮關(guān)鍵性作用。而TGFβ的纖維化作用主要通過(guò)TGFβ-Smad信號(hào)通路來(lái)進(jìn)行調(diào)控。Smad4作為Smad蛋白家族中唯一的輔助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是TGFβ-Smad信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白。
　　 本課題研究目的是應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Smad4在小鼠骨骼肌損傷部位的表達(dá)，阻斷TGFβ-Smad信號(hào)通路

2、的傳導(dǎo)，進(jìn)而達(dá)到抑制骨骼肌損傷后纖維化，促進(jìn)損傷愈合的作用。我們首先構(gòu)建以慢病毒為載體的Smad4 siRNA，在體外驗(yàn)證能夠抑制C2C12成肌細(xì)胞的Smad4基因及蛋白表達(dá)，再將以慢病毒為載體的Smad4 RNA干擾片斷采用局部注射的方式植入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在局部注射部位能夠長(zhǎng)期發(fā)揮抑制Smad4基因表達(dá)，降低Smad4蛋白分泌，阻斷TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。我們最后發(fā)現(xiàn)，注射慢病毒介導(dǎo)的Smad4-siRNA可最終抑制小鼠損傷

3、骨骼肌纖維化的形成，減輕疤痕的產(chǎn)生，并進(jìn)一步改善骨骼肌收縮功能，促進(jìn)骨骼肌損傷愈合。
　　 第一部分以慢病毒為載體的Smad4 siRNA的構(gòu)建與鑒定
　　 目的：構(gòu)建并鑒定以慢病毒為載體的Smad4小RNA干擾片段。
　　 方法：根據(jù)Smad4的基因信息，使用不同的在線siRNA序列設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)五條針對(duì)目的基因CDS區(qū)的siRNA序列以及一條亂序RNA序列作為對(duì)照。根據(jù)每條siRNA序列，設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)的DNA

4、模板單鏈，合成相應(yīng)的DNA單鏈。將DNA單鏈退火，與siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體(pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector)連接后進(jìn)行PCR鑒定，并將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。選取siRNA1、siRNA2、siRNA3三條序列進(jìn)行下一步研究。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提，使用siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，觀察病毒轉(zhuǎn)染效率。采用Real-time PCR和Western blot的方法檢測(cè)基因干預(yù)

5、后NIH3T3細(xì)胞中smad4基因和蛋白的表達(dá)情況。選取siRNA1進(jìn)行下一步研究。將siRNA1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度，并進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn)。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建出3條Smad4 siRNA，PCR鑒定5條克隆均為陽(yáng)性克隆，并經(jīng)DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)序列完全吻合。將3條Smad4 siRNA及一條作為對(duì)照的Negative siRNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，以綠色熒光做為參照，計(jì)算

6、出轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞的效率大約為75％，基本能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，3條siRNA均能抑制NIH3T3細(xì)胞中smad4的基因與蛋白表達(dá)(P<0.05)，其中又以siRNAl的基因沉默效率最高，可達(dá)到80%以上。選取siRNA1進(jìn)行下一步研究。將siRNA成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并生產(chǎn)出病毒液后，使用dPBS將病毒顆粒濃度調(diào)整至：1×104ifu/μl，-70℃保存病毒液，

7、待用。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建出Smad4 siRNA序列，發(fā)現(xiàn)能有效抑制NIH3T3細(xì)胞內(nèi)Smad4基因及蛋白的表達(dá)，有利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步開(kāi)展。
　　 第二部分以慢病毒為載體的Smad4 siRNA轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞及抑制Smad4表達(dá)的作用
　　 目的：了解以慢病毒為載體的Smad4 siRNA體外轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞的效率及抑制C2C12細(xì)胞Smad4基因及蛋白表達(dá)的能力。
　　 方法：將病毒液轉(zhuǎn)染

8、C2C12成肌細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，并用胰酶消化后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出感染的最佳MOI值。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，計(jì)算感染的最佳MOI值。采用Real Time-PCR和Western blot方法檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染C2C12C成肌細(xì)胞后Smad4基因和蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：慢病毒介導(dǎo)的Smad4-siRNA體外轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞后，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)均證實(shí)MOI值為

9、6時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)99%以上，同時(shí)并不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。Real Time-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，C2C12細(xì)胞培養(yǎng)3代后，Smad4-siRNA仍然能夠有效沉默Smad4基因和蛋白的表達(dá)，沉默效率在85%以上。
　　 結(jié)論：以慢病毒為載體的Smad4 siRNA可成功轉(zhuǎn)染體外C2C12成肌細(xì)胞，并能有效抑制Smad4基因及蛋白的表達(dá)。
　　 第三部分以慢病毒為載體的Smad4 siRNA在體轉(zhuǎn)染

10、小鼠急性鈍挫傷骨骼肌及抑制Smad4表達(dá)的作用
　　 目的：了解以慢病毒為載體的Smad4 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠急性鈍挫傷骨骼肌的效率及抑制鈍挫傷骨骼肌Smad4基因及蛋白表達(dá)的能力。
　　 方法：用自制打擊裝置將72只g雌性C57b1小鼠(體重20～25)右側(cè)腓腸肌中段造成急性鈍挫傷模型，隨機(jī)分為三組(每組24只)，包括：①PBS對(duì)照組；②Lv siRNA注射組；③LvNegative注射組。小鼠打擊傷后10d，分別在損

11、傷部位注射PBS0.1ml、Lv siRNA(濃度1×106ifu/μl)、LvNegative(濃度1×106ifu/μl)。分別于傷后第7、14、21、28d，各組隨機(jī)抽取6只小鼠處死取材。熒光顯微鏡下觀察局部GFP表達(dá)情況。將損傷部位骨骼肌及心臟、肝臟、腎臟、腦組織取材行Real Time-PCR和Western blot檢測(cè)Smad4基因和蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步了解Smad4-siRNA在小鼠體內(nèi)抑制Smad4表達(dá)的情況。

12、>　　 結(jié)果：以慢病毒為載體的Smad4-siRNA注射至損傷小鼠骨骼肌局部后，在LvNegative注射組和Lv siRNA注射組小鼠損傷骨骼肌部位均可檢測(cè)到GFP表達(dá)，在Lv siRNA注射組的肝臟、心臟、腎臟及腦組織內(nèi)并未檢測(cè)到GFP表達(dá)，RealTime-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以慢病毒為載體的Smad4-siRNA能夠有效抑制小鼠體內(nèi)損傷部位骨骼肌Smad4基因和蛋白的表達(dá)，并不影響肝臟、心臟、腎臟及腦組織

13、的Smad4基因和蛋白的表達(dá)，表明采用慢病毒局部注射的方法能夠成功將目的基因轉(zhuǎn)染小鼠損傷局部的骨骼肌細(xì)胞，并在注射部位穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，但并不會(huì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)染其他臟器。
　　 結(jié)論：以慢病毒為載體的Smad4 siRNA能夠成功轉(zhuǎn)染小鼠急性鈍挫傷骨骼肌，病毒并未轉(zhuǎn)染全身其他組織。采用慢病毒局部注射的方法能夠成功將目的基因轉(zhuǎn)染小鼠損傷局部的骨骼肌細(xì)胞，并可長(zhǎng)期發(fā)揮抑制Smad4基因及蛋白的表達(dá)，但并不影響其他組織Smad4基因及蛋白的

14、表達(dá)，是一種安全有效的方法。
　　 第四部分慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對(duì)小鼠損傷骨骼肌纖維化及愈合質(zhì)量的影響
　　 目的：了解以慢病毒為載體的Smad4 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠急性鈍挫傷骨骼肌后抑制骨骼肌纖維化、減輕疤痕生成，促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)的能力。
　　 方法：用自制打擊裝置將72只g雌性C57b1小鼠(體重20～25)右側(cè)腓腸肌中段造成急性鈍挫傷模型，隨機(jī)分為三組(每組24只)，包括：①PBS對(duì)照組；②Lv

15、 siRNA注射組；③LvNegative注射組。小鼠打擊傷后10d，分別在損傷部位注射PBS0.1ml、Lv siRNA(濃度1×106ifu/μl)、LvNegative(濃度1×106ifu/μl)。分別于傷后第7、14、21、28d，各組隨機(jī)抽取6只小鼠處死取材。將損傷部位骨骼肌取材行Masson染色以及Vimentin和α SMA免疫組化檢測(cè)，和Vimentin，α SMA、I型膠原的Western-Blot檢測(cè)，了解各組小鼠

16、急性鈍挫傷后腓腸肌局部纖維化情況，最后生物力學(xué)檢測(cè)各組小鼠骨骼肌的強(qiáng)直收縮和快速顫搐收縮能力，了解小鼠損傷骨骼肌愈合情況。
　　 結(jié)果：小鼠骨骼肌急性鈍挫傷后14、21、28天，Masson染色發(fā)現(xiàn)，Lv siRNA注射組骨骼肌疤痕生成明顯低于Lv Negative注射組和PBS對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化及Western blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，小鼠骨骼肌急性鈍挫傷后14、21、28天，代表骨骼肌纖維化程度的vimenti

17、n、α SMA和I型膠原纖維表達(dá)在Lv siRNA注射組均明顯低于對(duì)照組和Lv Negative注射組。表明局部注射Smad4-siRNA慢病毒液可明顯抑制骨骼肌急性損傷后纖維化的發(fā)生，減輕疤痕生成。生物力學(xué)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，在急性鈍挫傷后21天及28天，Lv Smad4注射組小鼠腓腸肌的強(qiáng)直收縮和快速顫搐收縮要明顯高于PBS對(duì)照組和Lv Negative注射組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明Smad4-siRNA注射組骨骼肌愈合質(zhì)量?jī)?yōu)于對(duì)照組和L