rAAV2介導(dǎo)bFGF基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠骨骼肌鈍挫傷修復(fù)的研究.pdf

1、研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠骨骼肌鈍挫傷造模后，應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）以及基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞分別對(duì)急性骨骼肌鈍挫傷小鼠進(jìn)行治療,從組織學(xué)、生物化學(xué)等方面觀察骨骼肌損傷修復(fù)過程中損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達(dá)以及血清肌酸激酶的變化，比較不同治療方法的修復(fù)效果，豐富相應(yīng)研究資料。
　　研究方法：
　　研究對(duì)象為100只清潔級(jí)雄性ICR小鼠，其中

2、20只小鼠不造模作為正常對(duì)照組（A組），對(duì)其余的小鼠進(jìn)行骨骼肌鈍挫傷造模后隨機(jī)分為4組：自然愈合組（B組）、細(xì)胞組（C組）、基因組（D組）、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組（E組）。各組再分別設(shè)3天組、7天組、14天、21天組（每組5只）。參照羅麗等的方法建立骨骼肌鈍挫傷模型，給小鼠腹腔注射5％水合氯醛將其麻醉，用脫毛膏將小鼠右后腿的毛清理干凈，用自制的重物打擊器，將小鼠后肢置于打擊器底板上，使后肢處于伸膝，踝背屈90。位置，腓腸肌正對(duì)PVC管底端中心部位

3、（管徑大于砝碼直徑），手持20g砝碼使其從81cm高的PVC管頂端順著管內(nèi)自由垂直落下打擊小鼠腓腸肌，重力為0.157N，動(dòng)能為0.157J，造模后保持皮膚完整，避免感染。
　　正常對(duì)照組不做處理，其余組分別于損傷后即刻利用微量注射器和微電極推進(jìn)器，向腓腸肌斜行進(jìn)針，深度約3mm，分別注射注射40ul PBS、40ul MSCs（數(shù)量約為1x105）、40ul rAAV2-bFGF、40ul轉(zhuǎn)染rAAV2-bFGF的MSCs（數(shù)量

4、約為1x105），注射時(shí)間不少于3min，留針2min，分籠飼養(yǎng)。跟蹤測(cè)試各組不同時(shí)間點(diǎn)下列指標(biāo)：骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化、損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達(dá)以及血清肌酸激酶的變化。
　　研究結(jié)果：
　　（1）HE染色光鏡和血漿CK活性變化提示,間充質(zhì)干細(xì)胞以及堿性成纖維生長(zhǎng)能促進(jìn)大鼠急性腓腸肌鈍挫傷后肌肉再生,減少瘢痕形成，加速損傷肌肉愈合的進(jìn)程,,提高肌肉愈合質(zhì)量。（2）傷后各組 bFGF表達(dá)都顯著高于A組（P

5、<0.05）；隨修復(fù)時(shí)間的增加，各組bFGF呈下降趨勢(shì)，到第21天時(shí) E組bFGF表達(dá)仍顯著高于正常對(duì)照組，各組 bFGF量由高到低為E組、C組、D組、B組、A組。（3）傷后各組膠原蛋白ImRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各組骨骼肌損傷后，各組I型膠原mRNA表達(dá)小幅上升，損傷后第7天，繼續(xù)上升，第14天開始，I型膠原mRNA表達(dá)迅速上升，在21天時(shí)達(dá)到峰值，E組膠原蛋白ImRNA表達(dá)量最低。與A組相比，除第3天外，各組均有非常顯著性差異（P<0

6、.01）。（4）各組膠原蛋白III mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第7天達(dá)到峰值，各組膠原蛋白III mRNA表達(dá)量由高到低依次是B組、D組、C組、E組、A組，說明間充質(zhì)細(xì)胞及堿性成纖維生長(zhǎng)因子抑制骨骼肌鈍挫傷小鼠損傷局部組織I、III型膠原mRNA的表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　?。?）成功包裝重組腺相關(guān)病毒 rAAV2-bFGF,轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞后可表達(dá)報(bào)告基因，目的基因bFGF也高效表達(dá)。（2）rAAV2-bFG