小鼠骨骼肌細胞SelW基因的RNA干擾研究.pdf

1、本研究中SelenoproteinWmRNA和蛋白的下調(diào)采用RNA干擾技術，首先根據(jù)目的mRNA翻譯區(qū)序列合成了21bp長的，具有特殊結構要求的雙鏈siRNA，參照文獻記載，選取對小鼠骨骼肌細胞轉染效率較高的陽離子脂質體Lipofactamine為轉染試劑，使其與合成的siRNA形成復合體，利用胞飲和范德華力作用機理，將復合體導入小鼠骨骼肌細胞；當復合體成功進入細胞后，利用細胞所特有的機制，與細胞內(nèi)特殊蛋白形成沉默復合物，發(fā)揮剪切作用，

2、達到降解目標mRNA的目的。隨后，利用蛋白印記和熒光實時定量PCR技術對細胞模型中的目標基因及其表達蛋白的動力學變化進行研究，細胞狀態(tài)的變化由流式細胞術進行測量。轉染效率通過轉染熒光標記的與目標序列無同源性的siRNA進行報告。本研究平行地在原代細胞和傳代細胞進行。 在針對C2C12細胞系中SelW基因的RNA干擾實驗中，最高的干擾效率見于轉染后24小時，本實驗的轉染效率為50％至70％。 在陽性小RNA效能比較實驗中，

3、選取生物學特性穩(wěn)定的傳代細胞作為實驗材料，實驗用細胞依轉染不同的兩個合成的siRNA分為組1，組2，并按轉染試劑推薦的常規(guī)劑量，分別轉染1ug小RNA。24小時和48小時后分別進行流式細胞術檢測。 在劑量反應檢測實驗中，選取實驗證明具有良好效果的1號siRNA進行實驗，將肌細胞分為6組，分別對應6個梯度進行實驗，以便依次梯度降低SelWmRNA水平，考察針對小鼠骨骼肌細胞的合適轉染劑量。每組依次轉染2ug，1.5ug，1.2ug

4、，1ug，0.5ug，0.25ugsiRNA，各組依次按1～6編號。24小時后分別進行檢測。 在2個合成siRNA干擾效能比較實驗的基礎上，在實驗確定了小鼠肌細胞最適的siRNA轉染劑量后，進行了干擾效率檢測實驗，實驗設立陽性組、陰性組和空白對照組3組，分別轉染1號陽性siRNA、陰性siRNA(各lug)和不轉染siRNA(不轉染任何外來物質僅進行培養(yǎng)基更換)。 上述所有實驗都進行后續(xù)檢測，包括：流式細胞術、定量PCR

5、和Westernblot，分別針對實驗用細胞狀態(tài)、目的基因和蛋白的變化。 結果： 1.兩個合成siRNA都可以引起RNA干擾，但從流式細胞術檢測到的其引起細胞凋亡結果看，二者的工作效能存在差異，1號(31.7％)優(yōu)于2號(14.5％)，因此1號siRNA選做后續(xù)實驗之用。轉染后24小時為最佳檢測時段。 2.在傳代細胞劑量反應實驗中，當轉染劑量為2ug，1.5ug，1.2ug時，會導致50％至70％的細胞層脫落，細

6、胞死亡過多導致細胞無法回收，使測定無法進行；當轉染劑量為1ug，0.5ug，0.25ug時，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，凋亡率分別為32.5％，12.4％，6.58％；上述3組中SelWmRNA的量通過標準曲線法實時定量PCR進行了測定，分別是0.25，0.39，0.524；對蛋白檢測時，假定組6中SelW蛋白的量為50，組4，5，6中蛋白的相對量為：17.26，31.08和50。所有證據(jù)指出，1ugsiRNA為最適合劑量，可以激發(fā)最高的干擾效

7、率，并在細胞健康與轉染干擾之間維持平衡。 3.在傳代細胞RNA干擾效率檢測實驗的流式細胞術檢測結果表明，最高的凋亡率發(fā)生在RNA干擾效率檢測實驗中，為37.5％(陽性組)；與陰性對照組(0.93％)和空白對照組(0.7％)相比差異顯著，分別為P=3.08×10-9＜0.05，P=2.95×10-9＜0.05。實時定量PCR檢測結果也顯示，陽性組細胞中SelWmRNA的量(0.275)與空白對照組(0.996)相比也下降了72.4

8、％；陰性對照組(0.9867)與空白對照組(0.996)相比下降了0.93％。蛋白含量變化的測定中，假定空白對照組中SelW蛋白的量為標準(100)，則陽性組的SelW蛋白的相對量為：25.07；陰性對照組的SelW蛋白的相對量為：98.75；與空白對照中蛋白量相比，陽性組與陰性組的量分別下降了74.93％，1.25％。 值得指出的是，實施于原代細胞的劑量反應實驗、RNA干擾效率檢測實驗結果與傳代細胞相似，只是因干擾而引起的量的

9、改變相對較弱：劑量反應實驗中，轉染過量siRNA導致細胞死亡；轉染1ug，0.5ug，0.25ug時，凋亡率為18.3％，8.1％，4.3％；SelWmRNA量為0.22，0.25，0.32；蛋白含量為39.5，46.2，50；RNA干擾效率檢測實驗中，陽性組、陰性組、空白對照組的凋亡率分別為20.0％，1.03％，0.4％；目的基因量平均為0.534，0.663，0.67；蛋白含量為41.2，48.8，50。 實驗證明，一、在

10、小鼠骨骼肌細胞代謝過程中，SelenoproteinW蛋白缺失會誘發(fā)細胞凋亡，SelenoproteinW蛋白的功能之一為凋亡抑制劑，揭示硒缺乏性肌病的病理機制并非僅組織變性、壞死一個途徑。二、RNA干擾存在著閾值效應，即轉染siRNA達到相應劑量后才會產(chǎn)生理想的干擾效果，這對于借助RNA干擾技術實施抗病毒和基因治療都具有非?，F(xiàn)實的意義。三、RNA干擾效率與基因豐度無關。雖然骨骼肌細胞中SelW基因表達量相對較低，但實驗證明RNA干擾同