蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸的提取及其體外抗肝癌作用的研究.pdf

1、目的：探討蠶蛹蛋白、蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸的最佳提取條件，并研究蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用。
　　 方法：以柞蠶蛹為原料，石油醚為脫脂溶劑，采用堿溶液浸提法提取蠶蛹蛋白，運(yùn)用單因素試驗(yàn)對(duì)固液比、浸提時(shí)間、溫度3個(gè)提取條件進(jìn)行優(yōu)選。提取出的蠶蛹蛋白經(jīng)雙氧水進(jìn)行脫色、除臭，得到黃色無(wú)臭味蠶蛹蛋白粉，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白的含量。將蠶蛹蛋白用胃蛋白酶水解后再經(jīng)酸水解來(lái)制取蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸。通過(guò)單因素試驗(yàn)探討了酶水解時(shí)

2、的底物濃度、pH值、酶濃度、水解溫度及水解時(shí)間與水解率的關(guān)系，采用正交試驗(yàn)L16(45)優(yōu)選酶水解的工藝條件。經(jīng)減壓蒸餾、中和、脫色等處理得到黃色澄清的蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸。以SMMC-7721細(xì)胞株為模型，研究蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸體外對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用。經(jīng)MTT法檢測(cè)藥物對(duì)人正常肝臟細(xì)胞株QSG-7701的毒性后，計(jì)算藥物安全濃度。將蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸配制成濃度為10－3mg/ml、10－2mg/ml、10ˉ1mg/ml、1mg/ml

3、和10mg/ml，分別與人肝癌細(xì)胞SMMC-7721共同培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液100ul，分別培養(yǎng)24、48、72h。采用MTT法測(cè)定OD值，評(píng)定蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸對(duì)肝癌細(xì)胞株的抑制作用；經(jīng)Hoechst33258(10mg/L)染色和倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察以檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞法測(cè)定細(xì)胞周期和Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　

4、結(jié)果：以石油醚為脫脂溶劑，提取蠶蛹蛋白的脫脂條件為固液比1:4，溫度50℃，時(shí)間4h。重復(fù)4次，脫脂率達(dá)到96％以上，所得蛋白粉的蛋白含量為83.5％，蛋白回收率為32.59％。胃蛋白酶水解蠶蛹蛋白的最佳酶解工藝條件為：底物濃度為1:5，pH值4.0，酶濃度1.5％，水解溫度60℃，水解時(shí)間5h。酶解后再經(jīng)鹽酸水解，其水解率可達(dá)到70％左右。所得溶液中氨基酸總量為2.241g/L，其中必需氨基酸含量為0.835g/L，占氨基酸總量的37

5、.26％。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明：蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸的最大無(wú)毒濃度為10mg/ml。不同濃度的蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸作用SMMC-7721細(xì)胞24、48和72h后，各用藥組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為9.0％～53.5％、12.4％～63.4％和16.8％～70.4％。各組與細(xì)胞對(duì)照組相比，OD值的差異有顯著性（P＜0.05），并顯示出對(duì)劑量和時(shí)間的依賴(lài)性。作用24、48、72h后，蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的IC50分別為4.691m

6、g/ml、1.469mg/ml和0.451mg/ml。Hoechst33258(10mg/L)染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，隨著劑量的加大，蠶蛹蛋白復(fù)合氨基酸能明顯促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)論：蠶蛹蛋白主要是球蛋白，部分溶于水和稀酸中，在堿性溶液中溶解度最大，故堿性溶液浸提法提取蠶蛹蛋白能有效的提高蛋白得率。運(yùn)用酶水解與酸水解相結(jié)合的方法來(lái)水解蛋白，同時(shí)具有了酶法的所需條件溫和，酶用量少，氨基酸破壞少和酸水解法的水