Flammeovirga pacifica WPAGA1中瓊膠酶基因的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)分析及降解產(chǎn)物的初步研究.pdf

1、本課題組前期從西太平洋深海沉積物中篩選到一株可直接降解龍須菜產(chǎn)生瓊膠寡糖的菌株Flammeovirga pacifica WPAGA1。對(duì)該菌進(jìn)行全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序，從中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)瓊膠酶基因。序列分析表明這9個(gè)瓊膠酶分屬于兩個(gè)糖苷水解酶家族，即GH16家族和GH86家族。對(duì)這9個(gè)瓊膠酶基因進(jìn)行克隆并成功表達(dá)出3個(gè)具有瓊膠酶活性的蛋白產(chǎn)物，命名為AgaP2049、AgaP4255及AgaP4383。將這3個(gè)瓊膠酶通過(guò)Ni柱純化得到了電泳純

2、的酶蛋白樣品。
　　酶學(xué)性質(zhì)研究表明 AgaP2049的最適反應(yīng)溫度為45℃，AgaP4255及AgaP4383的最適反應(yīng)溫度為50℃。AgaP2049及AgaP4255的最適pH為7.0，AgaP4383的最適pH為9.0。這三個(gè)酶在50℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，并且在pH5.0－10.0的范圍內(nèi)具有良好的pH穩(wěn)定性，這賦予了這三個(gè)酶較大的工業(yè)應(yīng)用潛力。Co2+和Mn2+對(duì)這三個(gè)酶有明顯的激活作用，Ag+和Cu2+則對(duì)其有強(qiáng)烈的

3、抑制作用，螯合劑EDTA對(duì)酶活有輕微的抑制作用。然而這三個(gè)酶對(duì)變性劑均有一定的耐受性。瓊膠酶對(duì)瓊膠的降解具有底物特異性，其降解瓊膠時(shí)的最適底物濃度為4 mg/mL。經(jīng)薄層層析和離子色譜法分析，瓊膠酶AgaP2049、AgaP4255及AgaP4383降解瓊膠生成的終產(chǎn)物均為為瓊膠三糖、新瓊四糖和新瓊六糖。
　　對(duì)瓊膠酶AgaP2049、AgaP4255及 AgaP4383的性質(zhì)進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)AgaP4383具有最大的工業(yè)應(yīng)用潛力

4、。因此對(duì)AgaP4383的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了單獨(dú)研究，結(jié)果表明AgaP4383降解商品化瓊膠的Km值為8.33 mg/mL，并且它同時(shí)也能直接降解龍須菜，Km值為19.81 mg/mL。為了實(shí)現(xiàn)瓊膠酶的大規(guī)模應(yīng)用，對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，正交優(yōu)化結(jié)果表明誘導(dǎo)瓊膠酶AgaP4383表達(dá)的最佳條件為：IPTG終濃度200μg/mL，于20℃誘導(dǎo)12 h。
　　以龍須菜為原料采用AgaP4383酶解法制備瓊膠寡糖，產(chǎn)物生成率為10％。