瓊膠酶及新瓊寡糖水解酶工業(yè)化應用的初步研究.pdf

1、海藻，是海洋中蘊藏的巨大的生物資源之一。由于其再生的特性，海藻被認為是第三代生物燃料和化學品。瓊脂糖是紅藻細胞壁的主要成分，瓊膠酶能夠水解瓊脂糖生成瓊膠寡糖。新瓊寡糖水解酶能斷裂新瓊寡糖的α-1,3糖苷鍵生成單糖。與酸水解相比，酶水解法以特異性強、產物均一等優(yōu)點，已經成為紅藻應用的發(fā)展趨勢。瓊膠寡糖具有多種生物活性，已廣泛應用于制藥、食品、化妝品等行業(yè)，但是這些應用在很大程度上依賴于瓊膠酶的高質量大規(guī)模生產。
　　本實驗室前期發(fā)現(xiàn)

2、Catenovulum sp.X3來源的瓊膠酶AgaXa屬于耐高溫酶，具有很高的穩(wěn)定性，并構建了產瓊膠酶工程菌E.coli BL21（DE3）-pET32a-AgaXa。通過對重組菌株的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，使得重組瓊膠酶的產量有了明顯的提高。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為5g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、15g/L蛋白胨；培養(yǎng)條件為pH7.5、誘導溫度30℃、0.1mM IPTG。在5L的發(fā)酵罐內利用線性補料的方式，瓊膠酶AgaXa

3、酶活力高達1.5×104U/L，比未優(yōu)化發(fā)酵的瓊膠酶產量提高了6倍。發(fā)酵液經離心、活性炭、超濾等初步處理后，利用鎳柱親和層析純化瓊膠酶，制備液體酶制劑。為了提高瓊膠酶的熱穩(wěn)定性，通過單因素和響應面實驗對酶保護劑的成分進行優(yōu)化，優(yōu)化后的酶制劑成分為1.8mM Na+、甘油16.97％、果膠2.1g/L、葡萄糖10.37g/L。添加優(yōu)化的酶保護劑后，在高溫85℃溫浴1h后，瓊膠酶依然有80%酶活殘留率。
　　作為第三代生物燃料的原材料

4、，瓊脂糖不能被釀酒酵母直接利用，其水解需要瓊膠酶和新瓊寡糖水解酶的共同參與才能產生酵母能直接利用的單糖。從菌株Aquimarina agarilytica ZC1中克隆了新瓊寡糖水解酶NH852基因，進一步構建重組質粒，轉入釀酒酵母EBY100中構建重組表面展示菌EBY100-pYD1-NH852。在半乳糖培養(yǎng)基誘導48h后，酶活力達到最高。對重組新瓊寡糖水解酶的酶學性質進行研究發(fā)現(xiàn)：重組酶NH852的最適反應溫度是30℃，當溫度高于4

5、0℃后酶活力迅速下降，在25～35℃酶的穩(wěn)定性較高；最適pH為6.0，在pH為6.0～10.0時酶活力相對穩(wěn)定。Ni+在0.1mM時對酶活力有促進作用（達160%），Mg2+在5mM時對酶活力有促進作用（達155%），而Fe3+、Cu2+等金屬離子及SDS等還原劑對酶活有明顯抑制作用。重組酶水解PNPG（4-硝基苯基-D-半乳糖苷）的Vmax值為27.03U/mg，Km值為0.0625mg/mL。
　　本實驗室前期證實不同于瓊膠酶

6、AgaXa具有多種水解產物（主要是新瓊八糖和新瓊十糖，還有少量的新瓊六糖和新瓊十二糖），Aquimarina agarilytica ZC1來源的β-瓊膠酶Aga575水解瓊脂糖得到唯一的產物新瓊二糖。首先瓊膠酶Aga575以3U/mg的酶活力水解瓊脂糖，瓊脂糖基本完全水解、形成新瓊二糖。進一步將10g/L新瓊二糖添加到培養(yǎng)基中作為唯一碳源，重組釀酒酵母EBY100-pYD1-NH852可以對新瓊二糖實現(xiàn)同步糖化發(fā)酵，最終乙醇產量為0.