瓊膠酶及新瓊寡糖水解酶工業(yè)化應(yīng)用的初步研究.pdf

1、海藻，是海洋中蘊(yùn)藏的巨大的生物資源之一。由于其再生的特性，海藻被認(rèn)為是第三代生物燃料和化學(xué)品。瓊脂糖是紅藻細(xì)胞壁的主要成分，瓊膠酶能夠水解瓊脂糖生成瓊膠寡糖。新瓊寡糖水解酶能斷裂新瓊寡糖的α-1,3糖苷鍵生成單糖。與酸水解相比，酶水解法以特異性強(qiáng)、產(chǎn)物均一等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為紅藻應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)。瓊膠寡糖具有多種生物活性，已廣泛應(yīng)用于制藥、食品、化妝品等行業(yè)，但是這些應(yīng)用在很大程度上依賴于瓊膠酶的高質(zhì)量大規(guī)模生產(chǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)

2、Catenovulum sp.X3來(lái)源的瓊膠酶AgaXa屬于耐高溫酶，具有很高的穩(wěn)定性，并構(gòu)建了產(chǎn)瓊膠酶工程菌E.coli BL21（DE3）-pET32a-AgaXa。通過(guò)對(duì)重組菌株的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使得重組瓊膠酶的產(chǎn)量有了明顯的提高。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為5g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、15g/L蛋白胨；培養(yǎng)條件為pH7.5、誘導(dǎo)溫度30℃、0.1mM IPTG。在5L的發(fā)酵罐內(nèi)利用線性補(bǔ)料的方式，瓊膠酶AgaXa

3、酶活力高達(dá)1.5×104U/L，比未優(yōu)化發(fā)酵的瓊膠酶產(chǎn)量提高了6倍。發(fā)酵液經(jīng)離心、活性炭、超濾等初步處理后，利用鎳柱親和層析純化瓊膠酶，制備液體酶制劑。為了提高瓊膠酶的熱穩(wěn)定性，通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)酶保護(hù)劑的成分進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的酶制劑成分為1.8mM Na+、甘油16.97％、果膠2.1g/L、葡萄糖10.37g/L。添加優(yōu)化的酶保護(hù)劑后，在高溫85℃溫浴1h后，瓊膠酶依然有80%酶活殘留率。
　　作為第三代生物燃料的原材料

4、，瓊脂糖不能被釀酒酵母直接利用，其水解需要瓊膠酶和新瓊寡糖水解酶的共同參與才能產(chǎn)生酵母能直接利用的單糖。從菌株Aquimarina agarilytica ZC1中克隆了新瓊寡糖水解酶NH852基因，進(jìn)一步構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入釀酒酵母EBY100中構(gòu)建重組表面展示菌EBY100-pYD1-NH852。在半乳糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)48h后，酶活力達(dá)到最高。對(duì)重組新瓊寡糖水解酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：重組酶NH852的最適反應(yīng)溫度是30℃，當(dāng)溫度高于4

5、0℃后酶活力迅速下降，在25～35℃酶的穩(wěn)定性較高；最適pH為6.0，在pH為6.0～10.0時(shí)酶活力相對(duì)穩(wěn)定。Ni+在0.1mM時(shí)對(duì)酶活力有促進(jìn)作用（達(dá)160%），Mg2+在5mM時(shí)對(duì)酶活力有促進(jìn)作用（達(dá)155%），而Fe3+、Cu2+等金屬離子及SDS等還原劑對(duì)酶活有明顯抑制作用。重組酶水解PNPG（4-硝基苯基-D-半乳糖苷）的Vmax值為27.03U/mg，Km值為0.0625mg/mL。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期證實(shí)不同于瓊膠酶

6、AgaXa具有多種水解產(chǎn)物（主要是新瓊八糖和新瓊十糖，還有少量的新瓊六糖和新瓊十二糖），Aquimarina agarilytica ZC1來(lái)源的β-瓊膠酶Aga575水解瓊脂糖得到唯一的產(chǎn)物新瓊二糖。首先瓊膠酶Aga575以3U/mg的酶活力水解瓊脂糖，瓊脂糖基本完全水解、形成新瓊二糖。進(jìn)一步將10g/L新瓊二糖添加到培養(yǎng)基中作為唯一碳源，重組釀酒酵母EBY100-pYD1-NH852可以對(duì)新瓊二糖實(shí)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵，最終乙醇產(chǎn)量為0.