黃酮類化合物芹菜素酶法合成體系的建立及條件優(yōu)化.pdf

1、芹菜素(apigenin)又稱為洋芹素、芹黃素，是一種天然存在的植物黃酮類化合物。芹菜素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等多種生理學活性，在醫(yī)藥和保健品領域具有廣闊的應用前景，需求量逐年增加。采用傳統(tǒng)的植物提取法需要消耗大量的有機試劑和植物原材料，而且分離純化步驟繁多，產(chǎn)率較低;化學合成法的反應條件苛刻，副產(chǎn)物較多。在體外利用酶促反應合成芹菜素的方法簡單、環(huán)保、反應條件溫和，可彌補前兩種方法的缺點，因此，具有很好的發(fā)展和應用前景。本

2、文旨在建立一種體外酶法合成黃酮類化合物芹菜素的新方法，以替代傳統(tǒng)的提取法和化學合成法。
　　首先，本研究參照植物體內(nèi)黃酮類化合物合成的途徑，設計了一條體外通過酶促反應合成芹菜素的途徑，該途徑包括四種關鍵酶，依次是4-香豆酰輔酶A連接酶1(4CL1)、查爾酮合酶2(CHS2)、查爾酮異構酶(CHI)和黃酮合酶Ⅰ(FNSⅠ)。本文從黃豆的根和葉子中分別克隆出CHI(gm)、4CL1(gm)基因，從高粱和芹菜葉子中分別克隆出CHS2(s

3、b)和FNSI(ag)基因。先在大腸桿菌體內(nèi)鑒定了這四種關鍵酶的活性，結果表明:在發(fā)酵液中檢測到相應黃酮類化合物的存在，說明這四種關鍵酶的基因能夠在大腸桿菌體內(nèi)進行功能性表達。將編碼這4個酶的基因構建到原核表達載體pET-32a上，并將測序正確的重組質(zhì)粒分別轉入到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達蛋白，利用鎳柱對可溶性表達的重組蛋白進行純化。SDS-PAGE電泳結果顯示，各融合蛋白的純度達到

4、了90％左右。
　　然后，利用純化后的融合蛋白酶與相應底物在體外進行酶促反應以合成芹菜素，并通過聚酰胺薄層色譜、液質(zhì)聯(lián)用儀鑒定所合成的產(chǎn)物。結果表明，純化的4CL1(gm)、CHS2(sb)、CHI(gm)、FNSI(ag)重組蛋白在體外都具有生物學活性，能夠?qū)⒏髯詫牡孜锎呋僧a(chǎn)物，最終合成芹菜素。
　　最后，為了提高反應產(chǎn)量，進行了酶促反應條件的優(yōu)化。逐一優(yōu)化反應體系的成分、pH值、溫度、時間、底物濃度等條件，確定了

5、4種融合蛋白各20μg/mL時，相對適宜的反應條件為200 mM Tris-HCl(pH7.2)，10％甘油，5mM MgCl2，5mM抗壞血酸，5mM ATP，300μM輔酶A，280μM丙二酰輔酶A，300μM4-香豆酸，0.1 mg/mL牛血清白蛋白，0.25mMα-酮戊二酸，0.1 mM亞鐵離子;反應溫度為28℃;反應時間為2h。
　　綜上所述，本文建立了一種體外利用酶促反應合成芹菜素的新方法，并進行了反應條件的初步優(yōu)化，