黃酮類化合物芹菜素酶法合成體系的建立及條件優(yōu)化.pdf

1、芹菜素(apigenin)又稱為洋芹素、芹黃素，是一種天然存在的植物黃酮類化合物。芹菜素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等多種生理學(xué)活性，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，需求量逐年增加。采用傳統(tǒng)的植物提取法需要消耗大量的有機(jī)試劑和植物原材料，而且分離純化步驟繁多，產(chǎn)率較低;化學(xué)合成法的反應(yīng)條件苛刻，副產(chǎn)物較多。在體外利用酶促反應(yīng)合成芹菜素的方法簡單、環(huán)保、反應(yīng)條件溫和，可彌補(bǔ)前兩種方法的缺點(diǎn)，因此，具有很好的發(fā)展和應(yīng)用前景。本

2、文旨在建立一種體外酶法合成黃酮類化合物芹菜素的新方法，以替代傳統(tǒng)的提取法和化學(xué)合成法。
　　首先，本研究參照植物體內(nèi)黃酮類化合物合成的途徑，設(shè)計了一條體外通過酶促反應(yīng)合成芹菜素的途徑，該途徑包括四種關(guān)鍵酶，依次是4-香豆酰輔酶A連接酶1(4CL1)、查爾酮合酶2(CHS2)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)和黃酮合酶Ⅰ(FNSⅠ)。本文從黃豆的根和葉子中分別克隆出CHI(gm)、4CL1(gm)基因，從高粱和芹菜葉子中分別克隆出CHS2(s

3、b)和FNSI(ag)基因。先在大腸桿菌體內(nèi)鑒定了這四種關(guān)鍵酶的活性，結(jié)果表明:在發(fā)酵液中檢測到相應(yīng)黃酮類化合物的存在，說明這四種關(guān)鍵酶的基因能夠在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行功能性表達(dá)。將編碼這4個酶的基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-32a上，并將測序正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，利用鎳柱對可溶性表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，各融合蛋白的純度達(dá)到

4、了90％左右。
　　然后，利用純化后的融合蛋白酶與相應(yīng)底物在體外進(jìn)行酶促反應(yīng)以合成芹菜素，并通過聚酰胺薄層色譜、液質(zhì)聯(lián)用儀鑒定所合成的產(chǎn)物。結(jié)果表明，純化的4CL1(gm)、CHS2(sb)、CHI(gm)、FNSI(ag)重組蛋白在體外都具有生物學(xué)活性，能夠?qū)⒏髯詫?yīng)的底物催化生成產(chǎn)物，最終合成芹菜素。
　　最后，為了提高反應(yīng)產(chǎn)量，進(jìn)行了酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化。逐一優(yōu)化反應(yīng)體系的成分、pH值、溫度、時間、底物濃度等條件，確定了

5、4種融合蛋白各20μg/mL時，相對適宜的反應(yīng)條件為200 mM Tris-HCl(pH7.2)，10％甘油，5mM MgCl2，5mM抗壞血酸，5mM ATP，300μM輔酶A，280μM丙二酰輔酶A，300μM4-香豆酸，0.1 mg/mL牛血清白蛋白，0.25mMα-酮戊二酸，0.1 mM亞鐵離子;反應(yīng)溫度為28℃;反應(yīng)時間為2h。
　　綜上所述，本文建立了一種體外利用酶促反應(yīng)合成芹菜素的新方法，并進(jìn)行了反應(yīng)條件的初步優(yōu)化，