性別決定基因家族成員-2基因sox-,2-對大鼠肝再生的作用研究.pdf

1、RESEARCHONTHEROLEOFSRY=BOX2GENESOX2INRATSLIVERI冱GENERArIONADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByZhuQiushiSupervisor：ProfDrXuCu

2、nshuanMay2010摘要性別決定基因家族成員2SOX2是SOX基因家族成員之一，與發(fā)育及細(xì)胞的分化與去分化相關(guān)。受$0X2在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相關(guān)方面研究的啟發(fā)，本文以大鼠再生肝為材料，用液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)(hydrodynamicsbasedtransgene，HDT)，通過基因過表達(dá)和RNA干涉的方法，初步研究了SOX2對大鼠肝再生過程的作用，為增加對SOX2在大鼠肝再生中的作用和分子機(jī)理的認(rèn)識提供了資料。本文根據(jù)已發(fā)布的信息對80

3、X2進(jìn)行了克隆，并從其基因序列上挑選了兩處靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)了兩條干涉RNA片段，將這些經(jīng)檢測正確的片段分別連接在真核表達(dá)載體pEGFPN1和干涉載體pGenesil10上，構(gòu)建了一條重組表達(dá)載體pEGFPN1$0X2及兩條重組干涉載體pGenesil10s199和pGenesil10哂370。而后，雙酶切表達(dá)載體pEGFPN1SOX2得到30X2的ORF，將其連接到干涉載體pGenesil10s199和pGenesil1Os370上，構(gòu)建出干

4、涉載體對應(yīng)的檢驗(yàn)載體pGenesil1Os199sox2、pGenesil1Os370sox2。將構(gòu)建成功的各檢驗(yàn)載體分別對再生肝模型大鼠進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因，并于轉(zhuǎn)基因后0、6、12、24、36、48、60、72和84h觀察轉(zhuǎn)干涉檢驗(yàn)載體pGenesil1Os199sox2、pGenesil1Os370sox2后的綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率(轉(zhuǎn)染率)與對照檢驗(yàn)載體pGenesil。10一hksox2相比是否有明顯下降，以此來判斷設(shè)計(jì)的干涉片段是

5、否對靶位點(diǎn)具有干涉作用。將表達(dá)載體和干涉載體分別進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因操作，通過各載體的轉(zhuǎn)染率找出其在大鼠再生肝組織中表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn)，并結(jié)合$0X2在大鼠再生肝組織中表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn)，得出該基因在大鼠部分肝切除(partialhepatectomyPH)后的最佳轉(zhuǎn)基因時(shí)間。根據(jù)以上結(jié)果，利用大鼠肝再生模型和液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)展開了80X2對大鼠肝再生作用的研究。將轉(zhuǎn)基因后的再生肝材料分別于PH后72、120和168h取出，用熒光顯微技術(shù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方

6、法和常規(guī)組織學(xué)技術(shù)對大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、表達(dá)動力學(xué)和肝指數(shù)等方面的結(jié)果進(jìn)行觀察與分析。經(jīng)過檢測SOX2克隆成功，其表達(dá)載體、干涉載體和檢驗(yàn)載體構(gòu)建亦成功。經(jīng)過對轉(zhuǎn)干涉檢驗(yàn)載體pGenesil1Os199sox2、pGenesil1Os370sox2和對照檢驗(yàn)載體pGenesil1Ohksox2后轉(zhuǎn)染率的檢測，針對兩處靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的兩條干涉片段均具有較明顯的干涉作用，其中尤以干涉片段s370的干涉效果最佳。經(jīng)過對轉(zhuǎn)表達(dá)載體和干涉載體后轉(zhuǎn)染