脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2基因lcn-,2-在大鼠肝再生中作用研究.pdf

1、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2基因lcn2編碼的小分子分泌型蛋白是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員之一,在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程中起調(diào)節(jié)作用。為探討lcn2過量或降低表達(dá)對(duì)肝臟再生的作用,本文以大鼠再生肝為材料,參照lcn2的mRNA序列信息設(shè)計(jì)克隆引物和帶酶切位點(diǎn)引物,采用分子克隆技術(shù)得到lcn2的克隆載體,測序證實(shí)正確后，以其為模板，進(jìn)一步將基因克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，構(gòu)建出表達(dá)載體pEGFP-N1-lcn2；另外，同樣參照lcn2

2、的mRNA序列信息，利用銳博、Genesil、Ambion和QIAGEN等網(wǎng)站的在線設(shè)計(jì)工具，查閱siRNA設(shè)計(jì)相關(guān)論文，針對(duì)lcn2mRNA的2個(gè)區(qū)域合成寡聚核苷酸片段連接到干涉載體pGenesil-1.0上,構(gòu)建出2個(gè)干涉lcn2mRNA的干涉載體pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616；酶切上述的表達(dá)載體pEGFP-N1-lcn2得到lcn2的ORF,將其連接到干涉載體pGenesil-1.0-l29

3、2和pGenesil-1.0-l616上,構(gòu)建出干涉載體對(duì)應(yīng)的檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-l.0-l616-lcn2。用尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因法,分別將構(gòu)建的表達(dá)載體pEGFP-N1-lcn2、干涉載體pGenesil-1.0-1292和pGenesil-1.0-1616及檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2注入大鼠體內(nèi),用熒光顯微技術(shù)觀

4、察肝組織的陽性細(xì)胞(數(shù)),并檢測轉(zhuǎn)lcn2后大鼠死亡率、肝指數(shù)、肝再生率和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。電泳和測序檢測表明，本論文構(gòu)建的lcn2的表達(dá)載體、干涉載體和檢驗(yàn)載體正確，有生物學(xué)作用。熒光顯微檢測表明，pEGFP-N1-lcn2、pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616載體的綠色熒光蛋白基因的表達(dá)高峰為12h，pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2載體的綠

5、色熒光蛋白基因的表達(dá)高峰為6h。并且與對(duì)照載體pGenesil-1.0-hk-lcn2相比，檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2的綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率比對(duì)照低5％左右，初步說明設(shè)計(jì)合成的兩個(gè)干涉片段均有一定干涉作用。肝指數(shù)檢測表明，在轉(zhuǎn)基因后120和168h,轉(zhuǎn)pEGFP-N1-lcn2載體組肝指數(shù)比對(duì)照和PH組小；在轉(zhuǎn)基因后72、120和168h,轉(zhuǎn)pGenesil-1.