大鼠再生肝的陷窩細胞基因表達譜分析及其opn的作用研究.pdf

1、肝臟是人體的重要器官之一,其強大的再生能力亦為學者重視。人們通常以Higgins和Anderson建立的大鼠2/3肝切除手術誘導的再生肝組織材料為對象研究肝再生分子機理。但肝臟由多種細胞組成,肝再生中各種肝臟細胞的生理、生化活動顯著不同,肝再生進程一般受到肝實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞之間的信號協(xié)調(diào)支配。因此將再生肝的各種細胞分離出來分別進行研究,將會使研究結(jié)果更加明晰、簡化。陷窩細胞(pit cell)是肝臟特異的自然殺傷細胞,不僅對腫瘤細胞

2、和病毒感染的肝細胞有直接殺傷作用,還參與調(diào)控肝再生的程度。盡管關于陷窩細胞在肝臟重建方面的功能有所闡述,但目前缺乏轉(zhuǎn)錄水平上深入研究陷窩細胞與肝再生的具體關系的研究。
　　 為從基因轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究陷窩細胞在肝再生中作用,本研究按Higgins等方法制作大鼠部分肝切除(partial hepatectomy,PH)模型,用兩步灌流法分散肝臟細胞,用60％的pereoll密度梯度離心和免疫磁珠分離肝陷窩細胞,用real-time

3、RT-PCR定量陷窩細胞的CD8和CD56 mRNA,用蛋白免疫印跡方法定量陷窩細胞的CD8和CD56蛋白。初步證實,從PH后各時間點分離的肝陷窩細胞成活率均在96％以上,CD8和CD56陽性細胞占95％以上,CD8和CD56 mRNA量穩(wěn)定,相應的蛋白量亦穩(wěn)定。
　　 本文接著從分離得到的高活性、高純度的陷窩細胞入手,用含11789個已知基因、13231個未知基因的Rat Genome2302.0芯片首次檢測大鼠2/3肝切除后

4、恢復10個時點的肝陷窩細胞基因表達譜,用real-time PCR驗證芯片結(jié)果的可靠性,用生物信息學和系統(tǒng)生物學方法分析它們與大鼠肝再生的相關性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),共970個基因(包括612個已知基因和358個未知基因)與大鼠肝再生相關。聚類分析顯示上述612個已知基因明顯呈現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)兩種表達模式,k-means按照它們在肝再生中的表達異同細分為Cluster1-8。GO分析顯示上調(diào)基因和下調(diào)基因均主要涉及23種生理活動。根據(jù)大鼠再生肝陷窩細

5、胞的基因表達模式和功能富集分析,發(fā)現(xiàn)陷窩細胞中的細胞因子、生長因子等活性物質(zhì)的分泌及其參與的信號級聯(lián)反應在肝再生啟動階段增強,肝陷窩細胞增殖主要在24-72h之間,免疫、炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄及效應發(fā)揮主要發(fā)生在肝再生終止階段,而陷窩細胞顯然不承擔創(chuàng)傷愈合和基礎物質(zhì)代謝的功能角色。
　　 其中,骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種活化淋巴細胞和巨噬細胞分泌的活性細胞因子,它的mRNA水平在2-72h再生肝陷窩細胞中顯著上

6、調(diào),最高達是對照的31倍。應用Pathway Studio7.0分析、建立陷窩細胞中肝再生相關基因之間的互作關系網(wǎng)發(fā)現(xiàn),與OPN有關聯(lián)的蛋白多達30多個,包括調(diào)節(jié)蛋白和靶蛋白,多種炎性疾病的發(fā)生與此基因互作網(wǎng)相關。說明OPN與再生肝的陷窩細胞密切相關。
　　 為闡明OPN對肝再生的影響,本研究克隆了opn基因,并構建了opn的表達載體pEGFP-N1-opn及其干涉載體pGenesil-1.0-opn(313)和pGenesil

7、-1.0-opn(887),在此基礎上繼續(xù)構建了干涉載體對應的檢驗載體pGenesil-1.0-HK.-opn、pGenesil-1.0-opn(313)-opn和pGenesil-1.0-opn(887)-opn。將各檢驗載體分別進行液壓轉(zhuǎn)基因,根據(jù)與OPN融合表達的綠色熒光蛋白陽性細胞率與對照相比的下降程度,判斷pGenesil-1.0-opn(313)比pGenesil-1.0-opn(887)的干涉效果強烈。將表達載體和干涉載體

8、分別進行液壓轉(zhuǎn)基因得出外源性基因或干涉片段的表達高峰時點,結(jié)合內(nèi)源性opn在大鼠再生肝組織中PH后6-12h表達最高,依據(jù)使內(nèi)源性和外源性opn的作用疊加的原則,選擇于PH前30h轉(zhuǎn)入表達載體,PH后0h轉(zhuǎn)入干涉載體。通過對大鼠死亡率、表達動力學、組織形態(tài)結(jié)構、再生肝指數(shù)、肝再生率等方面的結(jié)果分析表明:轉(zhuǎn)入opn表達載體后,炎癥反應和肝損傷明顯加劇。相反,干涉質(zhì)粒pGenesil-1.0-opn(313)能顯著降低肝系數(shù)和肝再生率,減少