厄貝沙坦對糖尿病大鼠心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及意義探討.pdf

1、目的:心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因，而慢性心功能衰竭是糖尿病心血管并發(fā)癥的重要表現(xiàn)形式之一。心肌纖維化在這一病理過程中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用，它通過引起心室進(jìn)行性僵硬、失去收縮性和心肌傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致心功能減退。然而，關(guān)于糖尿病心肌纖維化的機制仍不清楚。近來研究顯示，大約1/3間質(zhì)成纖維細(xì)胞來源于發(fā)生轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial-to-mesenchymaltransition，EndMT)，且EndMT是導(dǎo)致心肌

2、纖維化發(fā)展的早期事件。研究表明，腎素血管緊張素系統(tǒng)的活化是促進(jìn)纖維化行程的重要因素，它通過刺激TGF-β1產(chǎn)生、增強TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并分化成肌成纖維細(xì)胞等途徑，加速細(xì)胞外基質(zhì)生成。厄貝沙坦(irbesartan，Irb)是一種新型血管緊張素受體1阻斷劑（ARB），既往研究提示，它除具有降壓和降低蛋白尿作用外，還能夠減輕心肌肥厚和血管內(nèi)皮細(xì)胞損害、改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能不全等作用，其早期抗蛋白尿和保護(hù)內(nèi)皮功能的

3、作用是非降壓依賴的。厄貝沙坦對糖尿病大鼠心肌纖維化影響如何，以及其與EndMT的關(guān)系如何，是一個十分有趣的問題。本研究擬通過糖尿病大鼠模型和體外內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)實驗，探討厄貝沙坦對糖尿病大鼠心肌心肌纖維化的影響及其作用機制。
　　 方法:對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensiverat，SHR)進(jìn)行高糖、高脂飼料喂養(yǎng)2周，成功誘導(dǎo)胰島素抵抗后，予以一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，S

4、TZ，35mg/kg)。采用與自發(fā)性高血壓大鼠有相同遺傳背景的WKY(Wistar-Kyoto)大鼠作為正常對照組。然后，將糖尿病大鼠隨機分成2組，糖尿病組和Irb治療組。Irb治療組給予胃內(nèi)灌注Irb50mg/kg.d連續(xù)8周，心彩超計算左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、減速時間(DT)及應(yīng)用脈沖多普勒法測定二尖瓣口E峰、A峰值流速并計算E/A比值。光鏡觀察心肌病理改變。透射電鏡觀察心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞病理變化。激光共聚焦顯微

5、鏡技術(shù)(LSCM)觀察內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)物CD31和成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(FSP1)的雙染在心肌上的表達(dá)。WesternBlot檢測FSP1、α-SMA蛋白水平的表達(dá)。最后觀察Irb對上述各項指標(biāo)的影響。體外實驗中，觀察高糖（30mM）刺激人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)表型改變的影響。HAEC分成正常組，高糖組和Irb干預(yù)組。放射免疫法(RIA)檢測HAEC上清液中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的濃度。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(LSCM)觀察CD31和F

6、SP1的雙染在HAEC的表達(dá)。透射電鏡技術(shù)(TEM)觀察HG對HAEC超微結(jié)構(gòu)的影響。RT-PCR和WesternBlot檢測FSP1、α-SMAmRNA和蛋白水平的表達(dá)。最后觀察Irb對上述各項指標(biāo)的影響。
　　 結(jié)果:與WKY組大鼠相比，糖尿病大鼠表現(xiàn)出高血糖、高血脂、高血壓等病理生理特點。與此同時，糖尿病組發(fā)生顯著心肌纖維化和心肌肥厚。心功能檢測提示，與WKY組比較，DM組LVEF、FS和E/A顯著降低(P＜0.05)，而

7、DM+Irb組大鼠LVEF、FS、E/A(E峰/A峰)升高，LVIDd、LVIDs、DT降低(P＜0.05），提示IRB治療可顯著改善糖尿病大鼠心臟結(jié)構(gòu)重塑和心功能。透射電鏡顯示，正常組大鼠心肌血管內(nèi)皮平整而光滑，DM組心肌微血管內(nèi)皮指狀突起增多。LSCM可見心肌微血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物FSP1共表達(dá)。Irb可抑制高糖引起的上述改變(P＜0.05)。體外實驗中，高糖刺激的HAEC導(dǎo)致FSP1蛋白表達(dá)顯著增加，呈濃度依賴

8、性(5.5mM:0.08±0.01，15mM:0.57±0.04，30mM:1.25±0.06;P＜0.05vs.正常組)。高糖組(30mM)刺激HAEC誘導(dǎo)的FSP1表達(dá)呈時間依賴性(0h:0.04±0.001，12h:0.652±0.04，24h:0.98±0.04，48h:1.22±0.02，P＜0.05vs.control)。TEM顯示高糖使細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微絲明顯增多。LSCM可見CD31和FSP1表達(dá)重疊，且一些細(xì)胞獲得紡錘

9、樣的改變并失去CD31染色。RIA結(jié)果提示高糖顯著增加細(xì)胞上清液中的AngⅡ的濃度(P＜0.05)，Irb可抑制高糖引起的上述改變(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:通過本系列研究，我們初步得出以下結(jié)論:
　　 1.在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，心肌血管EndMT促進(jìn)早期心肌纖維化，這種作用可以被AngⅡ受體1拮抗劑抑制，而且獨立于其降壓作用之外。
　　 2.高糖可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的HAEC表達(dá)FSP1，且呈濃度和時間依

10、賴。
　　 3.Irb可以顯著抑制高糖所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，提示AngⅡ可能是其重要的介導(dǎo)機制。
　　 4.本研究為臨床早期應(yīng)用ARB治療糖尿病患者的心臟并發(fā)癥提供了新穎的理論依據(jù)。
　　 本研究的創(chuàng)新之處:
　　 1.首次應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)和動物實驗，探討了EndMT在糖尿病心臟纖維化發(fā)生中的作用，而高糖所誘導(dǎo)的AngⅡ表達(dá)增加可能是EndMT形成的重要機制。
　　 2.首次證實:AngⅡ受體1拮抗