低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響.pdf

1、實驗背景和目的：
　　近年來磁場的作用逐漸受到人們的重視，它是一種安全有效的物理治療手段，在治療骨關(guān)節(jié)等疾病方面已經(jīng)取得了良好的療效，早有報道證明體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞以及牛主動脈內(nèi)皮細胞的血管形成可以被脈沖磁場有效地促進，F(xiàn)GF-2的分泌也同樣可以被磁場所促進，因此人們不斷尋找一種利用磁場這種無創(chuàng)療法改善心血管疾病的途徑。近年來缺血性心臟病的發(fā)病率逐年上升，而治療缺血性心臟病的主要手段就是促進內(nèi)皮的再生，進一步使新的血管形成

2、。微血管內(nèi)皮細胞在功能上有許多與內(nèi)皮細胞相似的地方，它可以參與血管的再生，是心臟的一個重要組成部分，對改善心血管疾病起到重要的作用。但是現(xiàn)在對于這方面的研究很少，我們只能在探索中前進，尋找磁場發(fā)揮生物學效應(yīng)的最佳波形，強度以及時間，使磁場在治療心血管疾病上邁出一大步,為其在臨床的早日應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　實驗一：不同波形低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響
　　1.心肌微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)，利用

3、胰酶以及膠原酶消化法培養(yǎng)，用差速貼壁原理純化細胞。
　　2.實驗分為兩個大組：矩形波組以及三角波形磁場組，每大組又分為對照組和處理組，每個處理組內(nèi)各分為0.6mT、1.2mT、1.8mT和2.4mT四個磁場強度照射組。對照組不接受磁場輻照，其他條件輻照組均與磁場輻照組相一致。各磁場輻照組的心肌微血管內(nèi)皮細胞均于第一次傳代在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間后鏡下觀察見細胞貼壁時開始接受磁場輻照，選用脈沖磁場頻率為15Hz，輻照時間為4h/d，連

4、續(xù)照射5d。CCK-8法檢測細胞增殖情況，transwell小室法檢測細胞遷移情況，流式細胞儀測定細胞各周期的變化，Hoechst33258染色鑒定細胞凋亡狀況，F(xiàn)ITC標記的鬼筆環(huán)肽對細胞骨架染色，硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)液中NO含量的變化。
　　實驗二：三角波形低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和細胞周期的影響
　　1.胰酶和膠原酶消化法培養(yǎng)原代的心肌微血管內(nèi)皮細胞，差速貼壁法純化細胞。
　　2.取心肌

5、微血管內(nèi)皮2代細胞，將其分為4個組：即對照組、1.0mT組、1.4mT組和1.8mT組。對照組的細胞不曝磁，其他條件均與1.0mT、1.4mT及1.8mT組一致。1.0mT、1.4mT及1.8mT組的CMECs均于傳代后，鏡下觀察見細胞開始貼壁時，接受曝磁，以頻率為15Hz的脈沖磁場刺激4h/d，連續(xù)照射3d。MTT法檢測細胞增殖活性，transwell小室法檢測細胞遷移情況，流式細胞儀測定細胞各周期的變化。
　　實驗結(jié)果：

6、>　　實驗一：不同波形低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響
　　1.成功培養(yǎng)出原代心肌微血管內(nèi)皮細胞并成功純化。
　　2.矩形波作用后經(jīng)CCK-8檢測顯示4個磁場強度作用后與對照組相比細胞增殖水平均有提高，其中以1.8mT組增殖最為明顯（0.9679±0.057vs0.7552±0.0334；P＜0.01）。三角形波干預后0.6mT組與1.8mT組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），1.2mT組與2.4mT組

7、與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.矩形波輻照CMECs的遷移加快，各組遷移的細胞數(shù)（個/視野）與對照組比較均有顯著增多，其中以1.8mT組磁場強度作用最為明顯（48.00±4.18vs23.80±3.11，P＜0.01）。三角波0.6mT組和1.8mT組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），1.2mT組與2.4mT組與對照組相比沒有明顯增多（P＞0.05）。
　　4.經(jīng)流式細胞儀檢測，細胞經(jīng)矩形

8、波輻照后，各組與對照組比較細胞各周期（G1期，S期以及G2期）均有明顯變化，（G2+S）期的細胞明顯增多，（P＜0.01），其中以1.8mT組變化最為顯著。經(jīng)三角波輻照后1.8mT組和0.6mT組對周期均有一定的影響（P＜0.05），1.2mT組和2.4mT組與對照組相比細胞周期幾乎沒有變化（P＞0.05）。
　　5.在熒光顯微鏡下觀察，矩形波輻照后各組凋亡率均有減低（P＜0.05）。三角波輻照后0.6mT組和1.8mT組凋亡率同

9、樣減低（P＜0.05），1.2mT組和2.4mT組凋亡率與對照組相比無明顯差異（2.18±0.19vs2.30±0.35；2.24±0.27vs2.30±0.35；P＞0.05）。
　　6.經(jīng)矩形波輻照后細胞與對照組比較細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了重組，鏡下觀察見綠色熒光示經(jīng)FITC標記的鬼筆環(huán)肽染色的細胞骨架，紅色熒光為經(jīng)碘化吡啶（PI）染色的細胞核，經(jīng)矩形波磁場輻照后各組的熒光染色強度均增加，細胞膜下的應(yīng)力纖維增多，聚集形成了綠色束樣結(jié)

10、構(gòu)，肌動蛋白清晰可見，其中0.6mT組以及1.8mT組變化最為顯著，三角波輻照后0.6mT和1.8mT亦有相同表現(xiàn)。
　　7.經(jīng)矩形波輻照5d后，NO分泌能力測定顯示，與對照組相比，各組NO分泌能力均有明顯提高（P＜0.01）。經(jīng)三角波輻照后，0.6mT組與1.8mT組與對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），1.2mT組與2.4mT組與對照組相比NO分泌能力未見明顯提高（P＞0.05）。
　　實驗二：三角波形低頻脈沖磁場對

11、大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和細胞周期的影響
　　1.用MTT比色法測定表明，1.4mT組和1.8mT組CMECs的增殖能力與對照組相比有顯著提高（P＜0.05）；而1.0mT組經(jīng)磁場輻照后，細胞增殖與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.transwell小室法檢測細胞遷移能力，細胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后，顯微鏡(×200)下觀察計數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計學分析可見，磁場能夠促進CMECs遷移。1.4mT組和1.8mT組遷移

12、的細胞數(shù)（個/視野）與對照組比較差異顯著（P＜0.05），1.0mT組與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示，細胞經(jīng)3d曝磁后，1.4mT組和1.8mT組與對照組比較細胞各周期（G1期、S期和G2期）均有統(tǒng)計學意義，細胞處于增殖分化期的數(shù)量明顯增多，其中1.8mT的組變化最為顯著(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　在固定頻率下，大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的增殖、細胞周期、凋亡、遷移