大鼠肝、腎、胰器官簇移植的系列研究.pdf

1、動(dòng)物模型是進(jìn)行臨床器官移植研究的基礎(chǔ)。任何同時(shí)涉及到肝、腎、胰三個(gè)臟器功能衰竭的疾病，肝、腎、胰聯(lián)合移植是唯一的治療辦法。目前臨床已有肝、腎、胰三器官移植的報(bào)道，但多為單一器官移植的疊加。肝、腎、胰器官簇移植動(dòng)物模型的研究還未有報(bào)道，滯后于臨床，有必要進(jìn)行研究。 缺血再灌注損傷是移植中常見的問題之一，缺血再灌注引起的臟器損傷是一個(gè)連續(xù)不斷的過程，并最終導(dǎo)致臟器損傷。這個(gè)過程是在肝臟短暫缺氧并再氧合時(shí)觸發(fā)。實(shí)際上缺血再灌注損傷是抗

2、原成分獲取的結(jié)果，是影響臟器移植結(jié)果的重要因素，引起10%左右的早期移植后器官功能衰竭，并且急性和慢性排異的發(fā)生率較高。此外，由于邊緣性供體對(duì)于缺血再灌注損傷非常敏感，這加劇了供體器官的短缺。因此減少缺血再灌注損傷能明顯增加獲得手術(shù)成功的病人數(shù)量。然而，到目前為止仍沒有可以預(yù)防缺血再灌注損傷的有效方法。所以，為了保護(hù)細(xì)胞和器官的功能，需要通過廣泛的研究更好的了解肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制以及尋找合適的干預(yù)方法是必要的。 目前研究表

3、明IPRI和初期的及嚴(yán)重急性排斥反應(yīng)有關(guān)。初期的免疫反應(yīng)的意義及其與獲得性免疫反應(yīng)的關(guān)系目前較清楚。初期免疫反應(yīng)的初始信號(hào)的激活由樹突細(xì)胞遞呈。一些抑制性蛋白，表達(dá)危險(xiǎn)信號(hào)，被稱為熱休克蛋白，作為Toll樣受體的內(nèi)源性配體。細(xì)胞損傷造成胞外熱休克蛋白釋放，通過TLRS，誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞（特別是樹突細(xì)胞）的激活和成熟。另外一些研究證明，活性氧不僅誘導(dǎo)TLRS內(nèi)源性配體的產(chǎn)生，同時(shí)是TLR4在IPRI中的核心因素。 IPRI引起組

4、織損傷，導(dǎo)致移植物抗原遞呈細(xì)胞及進(jìn)入移植物的受體抗原遞呈細(xì)胞的激活，激活的抗原遞呈細(xì)胞遷移至二級(jí)淋巴組織，與T細(xì)胞作用后產(chǎn)生排斥反應(yīng)。激活的抗原遞呈細(xì)胞同時(shí)可以通過CD4+ CD25-T細(xì)胞克服T輔助細(xì)胞的抑制作用，產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)。減少IPRI和TLRS的激活可以使APS處在非激活狀態(tài)，導(dǎo)致抗原特異性免疫耐受。以前缺乏證據(jù)來支持IPRI和嚴(yán)重的宿主抗排斥反應(yīng)，可能是因?yàn)橛行У拿庖咭种苿┑氖褂谩５絹碓蕉嗟呐R床資料表明，IPRI和急性

5、排斥反應(yīng)有關(guān)，在初期的排斥反應(yīng)中有重要的作用。 高壓氧治療通過多途徑降低IPRI，包括移植物植入前、受體移植前后，在圍手術(shù)期減少IPRI和改善移植物功能，降低IPRI，能阻止移植物MHC-Ⅱ分子的上調(diào)，減少免疫應(yīng)答。高壓氧能抑制免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，減少M(fèi)HC-Ⅰ抗原的表達(dá)，減少術(shù)后免疫抑制劑的使用量。高氧液是利用量子化溶氧機(jī)制，以臨床常用的生理鹽水、乳酸鈉林格氏液等晶體為載體，這種液體對(duì)心肌、腦等組織的缺血有明顯的保護(hù)作用，

6、并發(fā)現(xiàn)高氧液能發(fā)揮晶體液之優(yōu)點(diǎn)，量子處理可使3O2→2O3。O3溶于水的能力在0℃時(shí)為O2的10倍，并能很快由2O3→3O2，輸入后可立即提高氧分壓和氧飽和度，改善組織供氧并能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度；O3還能降低血小板聚集力，減少纖維蛋白原的含量，增加纖維蛋白的溶解度，有利于進(jìn)一步改善微循環(huán)。靜脈輸氧療法有助于盡快緩解重要臟器的缺氧狀態(tài)，阻斷因組織持續(xù)嚴(yán)重缺氧所導(dǎo)致的病理生理反應(yīng)鏈。靜脈氧已經(jīng)在新生兒缺氧、心臟手術(shù)等方面取得了確切的療

7、效，并被證實(shí)是安全、可靠的。目前已有研究高氧液在移植中的作用，但主要集中在器官保存中。本研究在大鼠器官簇移植模型的基礎(chǔ)上初步探討高氧液對(duì)大鼠器官簇移植的保護(hù)作用。 第一部分大鼠肝、腎、胰器官簇移植模型的解剖學(xué)基礎(chǔ) 目的：為大鼠肝、腎、胰器官簇移植的開展提供解剖學(xué)基礎(chǔ)。 方法：35只SPF級(jí)SD（Sprague-Dawley）大鼠，觀察肝、腎、胰的形態(tài)，顯微鏡下解剖觀察肝、腎、胰等器官的血供來源、血液回流、血管變異

8、情況，觀察膽管、胰管、輸尿管的分布及其形態(tài)規(guī)律。SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)上述數(shù)值進(jìn)行描述。 結(jié)果：35只大鼠腹主動(dòng)脈、肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈直徑分別為2.2±0.4mm、8.8±0.6mm、7.8±0.6mm：肝、腎、胰血管細(xì)?。?0.3mm，1.0±0.2mm，<0.2mm）；肝上下腔靜脈的長(zhǎng)度為7.2±0.4mm；左腎動(dòng)脈開口至髂動(dòng)脈起始長(zhǎng)度為18.6±3.2mm；肝動(dòng)脈、胰腺血管有變異（分別為6/35、6/35）；3

9、5只大鼠肝、腎、胰器官均由腹主動(dòng)脈供血，靜脈血回流至下腔靜脈。可以設(shè)計(jì)出以腹主動(dòng)脈、下腔靜脈為主干的肝、腎、胰器官簇。采用腹主動(dòng)脈、下腔靜脈可以完成器官簇的移植手術(shù)。 結(jié)論：1、大鼠肝、腎、胰器官簇移植模型在解剖學(xué)上可行。2、肝、腎、胰器官簇移植在解剖學(xué)上比單一器官移植較簡(jiǎn)單， 第二部分大鼠肝、腎、胰器官簇移植模型的建立 目的:建立大鼠肝、腎、胰器官簇移植模型。 方法:在熟悉了解大鼠肝、腎、胰解剖學(xué)特點(diǎn)及

10、掌握顯微外科縫合技術(shù)基礎(chǔ)上，106只SPF級(jí)SD大鼠，300-365g，按體重進(jìn)行配對(duì)，受者略大于供者。供者手術(shù)，游離肝臟、右腎、胰腺、近端十二指腸，采用腹主動(dòng)脈灌洗，摘取肝、胰、十二指腸、右腎及與之相連的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈、右側(cè)輸尿管（帶膀胱壁）；器官簇修整，將腸系膜上靜脈、肝下下腔靜脈行袖套式準(zhǔn)備（分別用5F、6F介入用血管套管）。腸系膜上動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎。微血管夾阻斷肝下下腔靜脈。4℃乳酸林格液再次經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注，檢查是否滲漏及袖套是

11、否通暢。脾臟、肝左葉和肝中葉，保留肝右葉、三角葉和前后乳頭葉修整成肝、胰、十二指腸、右腎的器官簇；受體手術(shù)，器官簇整塊移植到切除肝、右腎的受者腹腔，血管重建行肝上下腔靜脈端端吻合、肝下下腔靜脈袖套吻合、門靜脈袖套吻合、腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合，帶胰十二指腸乳頭與受者十二指腸端側(cè)吻合，供體輸尿管膀胱壁瓣與受體膀胱壁吻合。 結(jié)果:53次手術(shù)中，46次順利完成，平均手術(shù)時(shí)間為4.3±0.6h。其中預(yù)實(shí)驗(yàn)13次，正式實(shí)驗(yàn)40次。預(yù)實(shí)驗(yàn)階段僅有1

12、只受體鼠存活超過2天，手術(shù)成功率不到10%，大鼠未能存活2天以上的主要原因有休克、腹腔內(nèi)出血、吻合口出血、下腔靜脈或動(dòng)脈吻合口狹窄、下腔靜脈或動(dòng)脈吻合口血栓形成、植入肝臟體積比過高導(dǎo)致器官復(fù)流后休克以及不明原因等。技術(shù)成熟后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)40次。手術(shù)時(shí)間：供體手術(shù)時(shí)間1.4-1.6h，平均1.45h，器官簇修整時(shí)間為8-11min，受體手術(shù)時(shí)間為2.7-3.5h，無肝期14-20min，平均17min。以術(shù)后存活>2d為手術(shù)成功標(biāo)志，40

13、只受體大鼠術(shù)后存活2天以上共21例，手術(shù)成功率為52.5%。未能存活2天以上的19只大鼠的主要死亡原因?yàn)殚T靜脈栓塞、麻醉過深、循環(huán)衰竭死亡、不明原因。 結(jié)論:盡管圍手術(shù)期死亡率較高，建立大鼠肝、腎、胰器官簇移植模型是可行的，為臨床及大鼠肝、腎、胰器官簇移植的開展和研究打下良好基礎(chǔ)。 第三部分:高氧液在大鼠肝、腎、胰器官簇移植運(yùn)用的初步研究 目的:探討高氧液對(duì)大鼠肝、腎、胰器官簇移植模型的保護(hù)作用，為新的保存液的研

14、發(fā)提供一些理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠、SD大鼠各32只，300-350g，其中Wistar大鼠作為供體，隨機(jī)分成高氧液灌注組（高氧乳酸林格液組，16只）和普通液灌注組（乳酸林格液，16只），SD大鼠作為異基因受體，受體重量大于供體。共完成異基因大鼠肝、腎、胰器官簇移植模型16對(duì)。器官簇獲取后高氧液灌注組經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注高氧乳酸林格液50ml后保存于高氧乳酸林格液；而普通液灌注組經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注乳酸林格液

15、50ml。灌注前經(jīng)供體下腔靜脈取血4ml，用作檢測(cè)術(shù)前大鼠生化指標(biāo)、透明質(zhì)酸、CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞，高氧液組與普通液組各10只。灌注結(jié)束后分別取高氧液組、普通液組器官簇左肝、左腎、胰尾組織行電鏡檢測(cè)，下腔靜脈流出液4ml檢測(cè)透明質(zhì)酸含量。移植術(shù)后第3天兩組各取10只大鼠經(jīng)下腔靜脈取血，檢測(cè)生化指標(biāo)、透明質(zhì)酸、CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞，肝、腎、胰組織行病理檢查并進(jìn)行急性排斥評(píng)分，兩組剩余6只大鼠觀察1周的生存率。應(yīng)用SPSS1

16、1.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間術(shù)前、組內(nèi)術(shù)前、術(shù)后CD8+CD28-T、ALT、Cr、Glu、HA比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；兩組術(shù)后CD8+CD28-T、ALT、Cr、Glu、HA比較采用協(xié)方差分析檢驗(yàn)；兩組術(shù)后病理評(píng)分比較采用Wicoxon秩和檢驗(yàn)；兩組1周生存率的比較采用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、移植術(shù)前兩組（高氧液組在前）ALT（39.20±2.74；4

17、0.80±4.71）、Cr（50.80±5.05；49.40±6.20）、Glu（4.74±0.28；4.69±0.36）、透明質(zhì)酸（46.5±9.39；43.75±7.12）、CD4+/CD8+、CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞（7.16±0.24；6.98±0.25），兩組比較，p>0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2、灌注后高氧液組、普通液組大鼠肝、腎、胰組織電鏡檢查結(jié)果 高氧液組：肝、腎、胰組織超微結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞核形態(tài)完整